大腸桿菌表達(dá)中出現(xiàn)包涵體怎么辦？怎么復(fù)性？
日期：2025-06-16 13:45:35
在大腸桿菌蛋白表達(dá)過程中，包涵體的形成是常見問題，主要由蛋白質(zhì)折疊異常、表達(dá)量過高或環(huán)境壓力導(dǎo)致。以下從減少包涵體形成和包涵體復(fù)性兩方面提供系統(tǒng)性解決方案：
一、減少包涵體形成的策略
（1）優(yōu)化表達(dá)條件
降低誘導(dǎo)溫度：低溫（16-25℃）可減緩蛋白質(zhì)合成速度，為折疊提供更多時(shí)間，例如在 IPTG 誘導(dǎo)時(shí)將溫度降至 20℃，可顯著降低包涵體比例。
控制誘導(dǎo)劑濃度：降低 IPTG 濃度（如 0.1-0.5 mM）或采用乳糖等溫和誘導(dǎo)劑，避免蛋白質(zhì)爆發(fā)式表達(dá)。
延長(zhǎng)誘導(dǎo)時(shí)間：采用對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后期誘導(dǎo)，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間（12-16 小時(shí)），減少細(xì)胞代謝壓力。
優(yōu)化培養(yǎng)基成分：添加滲透壓保護(hù)劑（如蔗糖、山梨醇）或氨基酸（如甘氨酸），改善細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。
（2）載體設(shè)計(jì)與融合標(biāo)簽
融合可溶性標(biāo)簽：
GST 標(biāo)簽：谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶，通過與谷胱甘肽親和層析輔助純化，同時(shí)提高可溶性。
Trx 標(biāo)簽：硫氧還蛋白，促進(jìn)二硫鍵形成，常用于含半胱氨酸的蛋白。
MBP 標(biāo)簽：麥芽糖結(jié)合蛋白，通過分子伴侶作用增強(qiáng)折疊，適用于小分子量蛋白。
添加分子伴侶或折疊酶：共表達(dá)伴侶蛋白（如 GroEL/GroES、DnaK/DnaJ）或折疊酶（如 PDI），輔助蛋白質(zhì)正確折疊。
（3）宿主菌株選擇
選用蛋白折疊能力強(qiáng)的菌株：
Rosetta 系列：補(bǔ)充稀有 tRNA，減少翻譯錯(cuò)誤導(dǎo)致的聚集。
Origami 系列：硫氧還蛋白還原酶（trxB）和谷胱甘肽還原酶（gor）缺陷，促進(jìn)胞內(nèi)二硫鍵形成，適用于分泌型蛋白。
Bl21(DE3)pLysS：低背景表達(dá)，適合毒性蛋白表達(dá)。
（4）分泌表達(dá)策略
融合信號(hào)肽：如 pelB、ompA 信號(hào)肽，引導(dǎo)蛋白分泌至周質(zhì)空間，利用周質(zhì)空間的氧化環(huán)境促進(jìn)折疊，減少胞質(zhì)內(nèi)聚集。
優(yōu)化信號(hào)肽切割位點(diǎn)：避免信號(hào)肽未正確切割導(dǎo)致的蛋白不穩(wěn)定。
二、包涵體復(fù)性的完整流程
（1）包涵體的提取與溶解
收集與破碎細(xì)胞：
離心收集菌體（5000-8000×g，10 分鐘），用 PBS 洗滌去除培養(yǎng)基雜質(zhì)。
超聲破碎或高壓均質(zhì)破碎細(xì)胞，破碎液 4℃離心（12000×g，20 分鐘），沉淀即為包涵體。
洗滌包涵體：
用含 0.5% Triton X-100 和 1-2 M 尿素的緩沖液洗滌 2-3 次，去除吸附的雜蛋白和脂類。
溶解包涵體：
使用 8 M 尿素或 6 M 鹽酸胍（變性劑）溶解包涵體，添加 10-100 mM DTT 或 β- 巰基乙醇（還原劑）破壞錯(cuò)誤的二硫鍵，4℃攪拌溶解 2-4 小時(shí)。
（2）復(fù)性方法與優(yōu)化
1. 常用復(fù)性方法
稀釋復(fù)性法：
操作：將溶解的蛋白溶液緩慢加入 10-100 倍體積的復(fù)性緩沖液（含 0.1-0.5 M 精氨酸、1-5 mM 氧化還原對(duì) GSH/GSSG，pH 7.0-9.0），室溫或 4℃靜置 12-24 小時(shí)。
優(yōu)點(diǎn)：操作簡(jiǎn)單，成本低；缺點(diǎn)：體積大，適用于小量蛋白。
透析復(fù)性法：
操作：將蛋白溶液裝入透析袋，依次通過含 8 M 尿素→6 M→4 M→2 M→0 M 尿素的復(fù)性緩沖液（逐步降低變性劑濃度），每次透析 4-6 小時(shí)，添加氧化還原對(duì)和滲透壓調(diào)節(jié)劑（如 PEG）。
優(yōu)點(diǎn)：變性劑濃度梯度可控，蛋白濃度較高；缺點(diǎn)：耗時(shí)較長(zhǎng)，需注意避免透析袋污染。
層析復(fù)性法：
原理：利用親和層析（如 Ni-NTA）或離子交換層析，在層析柱上實(shí)現(xiàn)變性劑梯度洗脫與蛋白復(fù)性同步進(jìn)行。
優(yōu)點(diǎn)：復(fù)性效率高（可達(dá) 50-80%），可同時(shí)純化；缺點(diǎn)：需特定層析柱，成本較高。
2. 復(fù)性緩沖液優(yōu)化
氧化還原體系：使用 1-5 mM GSH（還原型）和 0.1-1 mM GSSG（氧化型），比例通常為 10:1，促進(jìn)二硫鍵正確形成。
添加劑：
精氨酸（0.1-0.5 M）：抑制蛋白聚集，通過破壞疏水相互作用穩(wěn)定中間態(tài)。
PEG（5-10%）：模擬分子擁擠環(huán)境，促進(jìn)折疊；甘氨酸（1-2 M）：降低溶液極性，穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)。
去污劑（如 Triton X-100，0.01-0.1%）：抑制疏水表面聚集，適用于膜蛋白復(fù)性。
pH 與溫度：多數(shù)蛋白在 pH 7.5-9.0 復(fù)性，堿性環(huán)境減少巰基氧化；溫度控制在 4-25℃，避免高溫導(dǎo)致聚集。
3. 復(fù)性效率提升策略
降低蛋白濃度：復(fù)性時(shí)蛋白濃度控制在 0.1-1 mg/mL，避免高濃度導(dǎo)致的分子間聚集。
分步復(fù)性：先快速降低變性劑濃度至中等水平（如 2 M 尿素），形成部分折疊中間體，再緩慢降至 0 M，減少錯(cuò)誤折疊。
添加分子伴侶模擬物：如 GroEL 抗體或人工合成的分子伴侶，輔助中間體折疊。
三、復(fù)性效果驗(yàn)證與問題排查
SDS-PAGE 檢測(cè)：對(duì)比復(fù)性前后蛋白條帶，觀察可溶性蛋白比例及聚集情況。
活性測(cè)定：通過酶活性、結(jié)合活性等功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證復(fù)性蛋白的生物學(xué)活性。
常見問題與解決方案：
復(fù)性效率低：嘗試更換復(fù)性方法（如稀釋法→層析法），或優(yōu)化氧化還原對(duì)比例。
聚集重新形成：增加精氨酸濃度或添加 PEG，降低復(fù)性溫度至 4℃。
二硫鍵錯(cuò)誤：調(diào)整 GSH/GSSG 比例（如從 10:1 改為 5:1），或添加 Cu²+ 促進(jìn)氧化。
四、案例參考
重組人胰島素復(fù)性：采用稀釋法，在 pH 8.0 緩沖液中加入 1 mM GSH/0.1 mM GSSG 和 0.3 M 精氨酸，復(fù)性效率可達(dá) 60% 以上。
綠色熒光蛋白（GFP）復(fù)性：通過 Ni-NTA 層析復(fù)性，在洗脫液中逐步降低尿素濃度（8 M→0 M），同時(shí)添加 5% PEG，活性恢復(fù)率超 70%。
通過系統(tǒng)優(yōu)化表達(dá)條件與復(fù)性策略，可顯著提高重組蛋白的可溶性表達(dá)與活性回收率。若問題持續(xù)，建議結(jié)合蛋白結(jié)構(gòu)特性（如是否含二硫鍵、跨膜區(qū)）調(diào)整方案，或嘗試真核表達(dá)系統(tǒng)（如酵母、昆蟲細(xì)胞）避免包涵體形成。
