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酵母雙雜交自激活驗(yàn)證的實(shí)驗(yàn)步驟

日期:2023-08-21 16:47:33

    酵母雙雜交(Yeast Two-Hybrid)是常用的蛋白質(zhì)相互作用的實(shí)驗(yàn)技術(shù)。在進(jìn)行雙雜交自激活驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)時,可以按照以下步驟進(jìn)行操作:

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實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備
 
    準(zhǔn)備兩個酵母菌株:一個是用于檢測蛋白質(zhì)自激活的菌株(例如AH109),另一個是作為質(zhì)粒攜帶者和報告基因表達(dá)的菌株(例如Y187)。
 
    構(gòu)建融合蛋白質(zhì)的載體:將待檢測蛋白的編碼序列克隆到適當(dāng)?shù)碾p雜交載體中,通常包括激活區(qū)域(AD)和DNA結(jié)合區(qū)域(BD)。
 
    驗(yàn)證載體的無毒性:通過轉(zhuǎn)化含有空載體的菌株來驗(yàn)證載體本身不會導(dǎo)致菌株生長異常。


 
轉(zhuǎn)化酵母菌株
 
    將質(zhì)粒攜帶者(例如Y187)和融合蛋白質(zhì)的載體(例如AH109)分別線性化,然后通過化學(xué)方法或電擊法將線性化DNA轉(zhuǎn)化到相應(yīng)的酵母菌株中。
 
    進(jìn)行選擇培養(yǎng):將轉(zhuǎn)化后的酵母菌分別移植到含有選擇性培養(yǎng)基的平板上,以篩選出具有正確載體的菌落。


 
進(jìn)行交互檢測
 
    鑒定陽性相互作用:將篩選得到的陽性菌落分別提取DNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增和序列分析,確認(rèn)融合蛋白質(zhì)的正確定序。
 
    進(jìn)行雙雜交驗(yàn)證:將陽性菌株分別轉(zhuǎn)化到兩個不同的抗性選擇培養(yǎng)基中(例如TDO和QDO培養(yǎng)基),觀察是否出現(xiàn)報告基因(如 HIS3、Ade2和LacZ)表達(dá)的現(xiàn)象。
設(shè)置對照組:設(shè)置空載體對照和已知相互作用的陽性對照,以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。


 
結(jié)果分析
 
    觀察菌落生長情況:在選擇培養(yǎng)基上觀察菌落生長,陽性菌株應(yīng)在TDO和QDO培養(yǎng)基上能夠生長。
 
    檢測報告基因表達(dá):使用相應(yīng)的檢測方法(如X-gal染色、HIS3和Ade2的活性檢測)來測試報告基因的表達(dá)水平,以確認(rèn)蛋白質(zhì)的相互作用。
 
    以上步驟僅概述了雙雜交自激活驗(yàn)證的基本流程,具體的實(shí)驗(yàn)操作和條件可能因?qū)嶒?yàn)?zāi)康暮驮噭┖械炔煌兴町悺T谶M(jìn)行實(shí)驗(yàn)前,請仔細(xì)閱讀相關(guān)文獻(xiàn)和試劑盒的說明,并按照其中提供的操作指南進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

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