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merip-qPCR實驗原理步驟

日期:2023-08-15 10:35:43


    merip-qPCR(MeRIP-qPCR)是一種結合甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP)和實時定量聚合酶鏈反應(qPCR)的方法,用于檢測RNA上的甲基化修飾。

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MeRIP實驗的步驟如下:
 
?    1、甲基化RNA免疫沉淀(MeRIP):首先,通過使用特異性的抗體(如MeRIP抗體)將甲基化的RNA以及其周圍的非甲基化RNA選擇性地免疫沉淀。這個步驟可以通過將細胞或組織的RNA與抗體一起孵育,然后利用表面修飾的磁珠或蛋白A/G瓊脂糖顆粒來捕獲和富集甲基化的RNA。
 
?    2、甲基化RNA的洗滌和釋放:沉淀后,對甲基化RNA進行洗滌,以去除非特異性結合的RNA分子。然后,通過使用高鹽緩沖液或其他適當的方法來釋放沉淀的甲基化RNA,并將其轉移到新的反應管中。
 
?    3反轉錄和合成cDNA:通過使用逆轉錄酶,將被釋放的甲基化RNA轉錄成相應的互補DNA(cDNA)。反轉錄過程中需要引入逆轉錄引物(與RNA相互補)以合成cDNA。
 
?    4實時定量聚合酶鏈反應(qPCR):將合成的cDNA作為模板,利用特異性引物和熒光探針進行實時定量聚合酶鏈反應。獲取反應的熒光信號,并根據熒光信號的變化來定量甲基化RNA的豐度。
 
?    通過MeRIP-qPCR實驗,可以定量檢測RNA分子上的甲基化修飾,為進一步研究RNA甲基化調控的生物學功能提供重要的信息。

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