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wb實驗的原理和步驟

日期:2023-07-20 16:55:19


    WB(Western Blotting)實驗,也稱為蛋白質印跡或免疫印跡法,是一種常用的蛋白質分析技術,用于檢測和定量特定蛋白質在混合樣本中的表達水平。
 
WB實驗的原理可以概括為以下幾個步驟:
 
    樣本制備:首先,需要從細胞或組織中提取目標蛋白質,并將其裂解為可溶性的蛋白質。一般會使用蛋白質提取緩沖液,并加入蛋白酶抑制劑來保護蛋白質的完整性。
 
    SDS-PAGE電泳:將提取的蛋白質樣本加載到聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)孔中,根據蛋白質大小進行分離。在SDS-PAGE過程中,蛋白質被帶負電荷的十二烷基硫酸鈉(SDS)包裹,使蛋白質線性展開,并以其分子量大小向電場方向遷移。
 
    蛋白轉移:將SDS-PAGE凝膠中的蛋白質經過電泳轉移到聚乙烯基化纖維素膜(PVDF)或氮化硅膜上。這一步將蛋白質從凝膠中轉移到膜上,使其能夠與抗體發生特異性的結合。
 
    阻斷:將轉移膜置于非特異性蛋白質阻斷劑(例如牛血清蛋白)中,封閉未被特異性抗體結合的蛋白質結合位點,以減少假陽性結果。
 
    一次抗體結合:將特異性的一次抗體加入,使其與目標蛋白質結合。這一次抗體一般是針對目標蛋白質的特定抗體。
 
    洗滌:用緩沖液洗滌膜上未結合的一次抗體,以去除非特異性結合。
 
    二次抗體結合:加入與一次抗體來源物種不同的二抗(二次抗體),通常是羊抗小鼠或小鼠抗兔子的抗體。這些二抗上標記有熒光素或酶(如辣根過氧化物酶-HRP)。
 
    洗滌:再次用緩沖液洗滌膜上未結合的二次抗體。
 
    信號檢測:根據使用的二次抗體標記物進行信號檢測。針對酶標記的二次抗體,可以使用底物與其產生化學反應后生成可視化的熒光或發光信號;針對熒光標記的二次抗體,直接在熒光顯微鏡下觀察。
 
    數據分析:通過檢測到的信號強度,在圖像分析軟件中進行定量分析,比較不同樣品中目標蛋白質的表達水平。
 
    WB實驗通過蛋白質的電泳分離、轉移、抗體特異性結合和信號檢測,可以用于檢測并定量目標蛋白質的表達水平,并提供關于蛋白質大小和相對豐度的信息。

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