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外泌體標記染色步驟

日期:2023-06-27 15:43:57

    外泌體是重要的細胞間通訊和信息傳遞功能。為了研究外泌體的分布、定位和功能,可以使用標記染色技術(shù)來可視化外泌體的存在和位置。
   一般而言,外泌體標記染色的步驟如下:
 
    培養(yǎng)細胞:選擇合適的細胞系,并在培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞至適當?shù)纳L狀態(tài)。
 
    收集細胞上清液:將細胞培養(yǎng)液收集到離心管中,并經(jīng)過一系列離心步驟,以去除細胞碎片和大顆粒物質(zhì)。
 
    外泌體富集:使用外泌體富集方法,如差速離心、超濾或密度梯度離心等,以將外泌體富集到較高的純度和濃縮度。
 
    固定外泌體:將外泌體沉淀物進行固定處理,常用的固定劑包括4% paraformaldehyde(PFA)等。固定可保持外泌體的形態(tài)和結(jié)構(gòu),防止其在后續(xù)染色過程中發(fā)生變化。
 
    涂片制備:將固定的外泌體沉淀物懸浮于適當?shù)娜芤褐校缓蟮卧诓A蜉d玻片上制作涂片。
 
    滲透處理:根據(jù)需要,進行滲透處理以提高染色效果。常用的方法包括使用0.1% Triton X-100等表面活性劑進行細胞膜的滲透。
 
    阻斷處理:為了減少非特異性結(jié)合和背景信號,使用適當?shù)淖钄嘁海ㄈ?% BSA、10% FBS等)或特定抗體來進行阻斷處理。
 
    抗體染色:根據(jù)需求選擇合適的抗體,如CD63、CD9、CD81等外泌體標志物的抗體。將稀釋好的一抗加到涂片上,充分孵育反應(yīng)。
 
    洗滌:使用緩沖液對涂片進行充分的洗滌,以去除未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。
 
    二抗染色:如果使用一抗是非標記的,則需要加入相應(yīng)的二抗(如熒光標記的抗小鼠IgG)來與一抗結(jié)合。將稀釋好的二抗加到涂片上,充分孵育反應(yīng)。
 
    洗滌:再次使用緩沖液對涂片進行充分的洗滌,以去除未結(jié)合的二抗和雜質(zhì)。
 
    核染色和封片:根據(jù)需要,可以使用核染色劑(如DAPI)來染色細胞核,并且最后在涂片上加入適當?shù)姆馄瑒┍Wo樣品。
 
    顯微鏡觀察:將涂片放置在顯微鏡下觀察,使用合適的熒光濾鏡組合來檢測和拍攝外泌體的熒光信號。
 
    注意:具體步驟可能會因?qū)嶒炇业膶嶋H情況、抗體選擇和細胞類型而有所不同。在進行外泌體標記染色之前,建議先進行相關(guān)文獻的閱讀和優(yōu)化實驗條件。

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