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酵母雙雜交篩選互作蛋白流程

日期:2023-05-29 16:31:20


    酵母雙雜交技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)互作篩選方法,通過(guò)利用酵母中的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域(BD)和激活域(AD)相互作用來(lái)檢測(cè)目標(biāo)蛋白在細(xì)胞內(nèi)是否存在互作關(guān)系。這項(xiàng)技術(shù)可以用于從大量的蛋白質(zhì)庫(kù)中篩選出與已知蛋白質(zhì)相互作用的候選分子。下面將介紹酵母雙雜交篩選互作蛋白的流程。
 
一、克隆兩個(gè)DNA片段
 
    首先需克隆兩個(gè)DNA片段:一個(gè)用于編碼轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合域BD,另一個(gè)用于編碼激活域AD。這兩個(gè)DNA片段需分別克隆到不同的表達(dá)載體中。其中,BD和AD的序列應(yīng)該很短,這有助于減少錯(cuò)配結(jié)合和非特異性激活的可能性。此外,在選擇BD和AD的序列時(shí)要避免它們之間的重疊區(qū)。BD和AD序列應(yīng)該還需要經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,以確保它們不對(duì)細(xì)胞造成毒性影響。
 
二、將兩個(gè)表達(dá)載體引入酵母細(xì)胞
 
    將BD載體和AD載體分別轉(zhuǎn)化到酵母細(xì)胞中,然后進(jìn)行培養(yǎng)。要確保轉(zhuǎn)化效率、酵母細(xì)胞健康狀態(tài)和表達(dá)載體的穩(wěn)定性。
 
三、篩選蛋白質(zhì)相互作用
 
    將需要篩選的蛋白質(zhì)庫(kù)與轉(zhuǎn)化后的酵母菌涂在含有選擇素的富含糖的平板上。這些平板上的細(xì)胞將生長(zhǎng)出許多小白色斑點(diǎn),這些斑點(diǎn)代表可能存在蛋白質(zhì)互作的情況。待這些小斑點(diǎn)變大之后,將它們收集到小管中,并進(jìn)行PCR擴(kuò)增,以確定它們的DNA序列。可在獲得的DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索匹配的蛋白資料庫(kù),查看其是否已知與目標(biāo)蛋白有互作關(guān)系。
 
    此外,在酵母雙雜交中還需注意以下事項(xiàng):
 
    1、轉(zhuǎn)化后的酵母細(xì)胞應(yīng)該是健康狀態(tài)的,并且表達(dá)載體應(yīng)該是穩(wěn)定的。
 
    2、選擇合適的蛋白質(zhì)庫(kù),以確保它包含感興趣的蛋白質(zhì)。通常,可以采用人類(lèi)或其它模式生物的基因庫(kù)。
 
    3、在初始篩選時(shí),應(yīng)該使用嚴(yán)格的選擇條件,以排除非特異性的互作。
 
    4、在一些情況下,可以采用一些輔助技術(shù),如藍(lán)/白斑點(diǎn)法和X-gal染色法,以提高篩選的靈敏度和特異性。
 
    酵母雙雜交技術(shù)是一種常用的蛋白質(zhì)互作篩選方法,可以從大量的蛋白質(zhì)庫(kù)中篩選出與已知蛋白質(zhì)相互作用的候選分子。在進(jìn)行這項(xiàng)技術(shù)時(shí),需要注意一些注意事項(xiàng),并嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)流程進(jìn)行操作。


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