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畢赤酵母表達系統操作應用指南

日期:2023-05-25 14:39:48


一、實驗前準備

1、畢赤酵母菌株選用
    根據目標表達蛋白的種類和性質,選擇適合的畢赤酵母菌株,例如X-33、GS115等菌株。
 
2、選擇表達載體
    根據需要選擇不同的表達載體,常用的有pPICZ、pPIC9、pGAPZ等載體。
 
3、選擇啟動子和信號肽
    根據表達蛋白的種類和性質,選擇適合的啟動子和信號肽。常用的啟動子有AOX1、GAP等,常用的信號肽有α-factor、Kex2等。
 
4、設計引物合成模板并克隆
    根據目標序列設計引物并克隆到表達載體中,通常采用PCR擴增目標序列并構建重組載體。進行克隆前,應該檢查引物序列是否正確,并選擇適合的限制酶進行酶切。
 
5、菌種接種培養
    取出冷凍保存的畢赤酵母菌株,接種在YPD固體培養基上,進行單克隆篩選和擴增。選用單克隆菌株接種到液體培養基中進行大量擴增,用于后續實驗。
 
6、培養基制備
    準備適合的表達培養基,通常采用BMGY培養基進行前期培養,采用BMMY培養基進行表達。
 
7、質粒提取
    在進行重組畢赤酵母工程表達前,需要將表達載體從大腸桿菌中提取并純化。
 
二、重組畢赤酵母工程的表達
 
1、初篩
    將酵母菌株接種到BMGY液體培養基中,進行預培養。然后將菌株移植到BMMY液體培養基中,使其進入誘導表達階段。通過測定菌株OD值和表達蛋白的分子量,初步篩選出表達較好的菌株。
 
2、優化條件
    根據初篩結果,調整表達條件,包括溫度、pH值、誘導時間、誘導劑濃度等參數進行優化,以獲得最佳的表達效果。
 
3、收獲表達產物
    收獲表達過的畢赤酵母菌株,加入混合物中(如裂解緩沖液),使其發生破裂并釋放出表達產物。通過離心等方式,收集沉淀物或上清液,提取表達產物并進行純化。
 
4、驗證表達產物
    對得到的表達產物進行質譜鑒定、SDS-PAGE凝膠電泳等檢驗手段進行驗證,檢測表達產物的分子量和純度,并對其進行功能分析。
 
三、實驗注意事項
 
    在操作前應該全面了解畢赤酵母菌株的生長和表達特點,以及各種培養基和表達載體的優缺點。
 
    1、在接種前,應該預先進行酵母菌株的檢測和鑒定,確保它們的純度和活性。
 
    2、在誘導表達過程中,一定要嚴格控制條件和參數,避免對表達效果產生不良影響。
 
    3、表達產物收獲后,應及時進行純化和驗證,以保證獲得高品質的表達產物。
 
    4、操作過程中,應該注意實驗材料的無菌操作,使用優質的試劑和耗材,避免對實驗結果產生影響。
 
四、實驗總結
 
    畢赤酵母表達系統是一種可靠和高效的重組蛋白表達方法。在實驗過程中,需要充分了解畢赤酵母的生長和表達特性,合理選擇表達載體和啟動子,并進行優化條件,以獲得高品質的表達產物。同時,在操作過程中,應該注意實驗材料的無菌操作,使用優質的試劑和耗材,避免對實驗結果產生影響。


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