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大腸桿菌抗原抗體分離結合純化效價測定

日期:2023-05-16 13:11:44


    大腸桿菌可以引起各種疾病的腸道細菌。為了研究大腸桿菌感染機理,需要對其抗原和抗體進行分離、結合和測定。本文將介紹大腸桿菌抗原抗體分離結合純化效價測定的相關技術和方法。
 
一、大腸桿菌抗原制備
 
制備大腸桿菌抗原通常有兩種方法:
 
培養和收集大腸桿菌

    首先需要培養大腸桿菌。將大腸桿菌接種到含有適當營養物質的培養基中,通過搖床或震蕩培養。然后,將培養出的細胞收集下來,通過離心、洗滌等步驟得到細胞沉淀作為抗原。
 
表達大腸桿菌蛋白

    另一種方法是利用重組DNA技術,將大腸桿菌蛋白質基因克隆到表達載體中,并在無菌條件下轉化到大腸桿菌中進行表達。表達完成后,將大腸桿菌收集下來,將其破裂并收集蛋白質以作為抗原。
 
二、大腸桿菌抗體制備
 
制備大腸桿菌抗體的方法通常有以下幾種:
 
培養細胞得到多克隆抗體

    將抗原注射到動物體內,讓其產生相應的免疫反應。然后收集動物的血清,并通過不同的方法制備出多克隆抗體。例如,可以采用親和層析純化法、SDS-PAGE電泳法等。
 
重組抗體技術

    除了動物血清制備多克隆抗體外,也可以利用重組DNA技術制備單克隆抗體。通過基因克隆和表達技術,得到重組的單克隆抗體。這類抗體具有高特異性和高親和力,適用于各種免疫學和生物學實驗。
 
三、抗原-抗體結合實驗
 
抗原-抗體結合實驗通常使用ELISA法進行測定。以下是步驟:
 
涂覆抗原

    將抗原溶液加入微孔板中,放置在4℃下過夜,使其牢固地附著在板上。
 
遮蔽無特異性結合

    將微孔板里的抗原溶液棄去,再加入蛋白質(如牛血清蛋白)等有機物,防止與特異性抗體結合。
 
加入稀釋后的抗體

    將稀釋后的抗體加入到孔中,與抗原作用。對于多克隆抗體,可以選擇一定稀釋度;對于單克隆抗體,通常使用較高的稀釋度。
 
加入次級抗體標記

    添加次級抗體(如HRP標記的抗鼠IgG抗體或抗兔IgG抗體),與抗體作用,用以標志檢測到的特異性抗體。
 
加入底物

    加入色素底物,觀察顏色變化。
 
讀取結果

    利用酶標儀等設備讀取樣品吸光度數據,計算出抗原-抗體結合效價值。
 
四、純化方法
 
    分離和純化大腸桿菌抗原和抗體通常采用以下幾種方法:
 
凝膠過濾層析法

    這是一種基于分子量差異的分離方法。將待分離的混合物加入到凝膠柱中,大分子會被凝膠過濾,小分子則能夠滲透進入凝膠孔中,從而實現分離。
 
陰離子交換層析法

    這是一種基于電荷差異的分離方法。將待分離的混合物加入到陰離子交換柱中,大分子具有更多的負電性,會與陰離子交換樹脂發生靜電作用,從而被分離。
 
親和層析法

    這是一種基于特異性結合的分離方法。在親和層析柱中填充配體(如親和素或抗體),然后將待分離的混合物通過柱子,特異性結合的物質可以被捕獲并從柱子上洗脫出來。
 
逆向相色譜法

    這是一種基于極性差異的分離方法。逆相色譜柱內充滿了疏水性樹脂,樣品中的組分在柱子中因極性不同而分散。此時,小分子化合物能夠滲透到樹脂孔徑中,而大分子組分則難以滲透,從而實現分離。
 
五、效價測定
 
     抗原-抗體結合效價測定是一種常見的免疫學實驗方法,用于評估抗體對待檢物質的特異性識別能力。具體步驟包括:
 
確定抗原標準品

    選擇合適的抗原,并制備出不同濃度的抗原標準品作為參考。
 
確定抗體稀釋度

    選擇合適的抗體,并制備出一系列不同稀釋度的抗體溶液。
 
建立ELISA系統

    將抗原溶液加入微孔板中,加入上述稀釋后的抗體溶液進行ELISA實驗,最終使得酶反應產生的顏色可以被觀察到。
 
讀取數據

    使用酶標儀讀取陽性和陰性對照以及標準抗原之間的差異。
 
計算效價

    根據標準曲線計算待測樣品的效價值。
 
    大腸桿菌抗原和抗體的分離、結合和測定是研究大腸桿菌感染機理和疫苗研制的重要手段。在實際應用中,需要根據具體情況選擇合適的技術和方法,以獲得準確、可靠的結果。


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