單克隆抗體實(shí)驗(yàn)公司的步驟有哪些？

日期：2025-01-03 13:30:44

單克隆抗體實(shí)驗(yàn)主要包括以下幾個(gè)關(guān)鍵步驟：

1、免疫動物
選擇動物：一般選用 6-8 周齡雌性 Balb/c 小鼠，因?yàn)槠溥z傳背景清晰，免疫反應(yīng)較為穩(wěn)定，且與常用的骨髓瘤細(xì)胞系在組織相容性上匹配較好，有利于后續(xù)的細(xì)胞融合和雜交瘤細(xì)胞的生長。

免疫方案制定：根據(jù)抗原的特性選擇合適的免疫方案。對于可溶性抗原免疫原性弱的情況，通常要加佐劑，如福氏完全佐劑和福氏不完全佐劑。初次免疫時(shí)，一般每只小鼠注射 50μg 抗原加福氏完全佐劑，皮下多點(diǎn)注射，間隔 3 周左右；第二次免疫，劑量和途徑同上，但使用福氏不完全佐劑；第三次免疫，劑量不變，不加佐劑，腹腔注射，7 天后采血測其效價(jià)；加強(qiáng)免疫，劑量 50μg，腹腔注射，3 天后取脾融合。

2、細(xì)胞融合

準(zhǔn)備細(xì)胞：

骨髓瘤細(xì)胞：在融合前 48-36 小時(shí)，將骨髓瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)。融合當(dāng)天，收集細(xì)胞，離心洗滌后重懸，進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)備用。常用的骨髓瘤細(xì)胞系有 SP2/0 等。

脾細(xì)胞：取已經(jīng)免疫的 Balb/c 小鼠，通過頸脫位致死，浸泡于 75% 酒精中消毒后，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液，計(jì)數(shù)備用。

融合操作：將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按一定比例混合，通常為 1:5-1:10，加入促融合劑聚乙二醇（PEG）。在 PEG 作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。

3、選擇性培養(yǎng)

培養(yǎng)基選擇：一般采用 HAT 選擇性培養(yǎng)基。在 HAT 培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤 - 鳥嘌呤 - 磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成 DNA 而死亡；未融合的淋巴細(xì)胞雖具有該酶，但本身不能在體外長期存活也逐漸死亡。只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤 - 鳥嘌呤 - 磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在 HAT 培養(yǎng)基中存活和增殖。

培養(yǎng)條件：將融合后的細(xì)胞懸液分裝到 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔 100μl，然后將培養(yǎng)板置 37℃，5% CO?培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。6 小時(shí)后補(bǔ)加選擇培養(yǎng)基，每孔 50μl，3 天后用選擇培養(yǎng)基半換液，經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞生長情況。

4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

篩選方法：通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，如酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）等，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞。

克隆化培養(yǎng)：將篩選出的陽性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆擴(kuò)增，可采用有限稀釋法或軟瓊脂平板法等。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。

5、單克隆抗體的大量制備

體內(nèi)誘生法：取 Balb/c 小鼠，首先腹腔注射 0.5ml 液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。1-2 周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約 1-2 周后，可見小鼠腹部膨大，用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。

體外培養(yǎng)法：將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶或生物反應(yīng)器中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量相對有限。

6、單克隆抗體的鑒定

抗體特異性鑒定：采用 ELISA、免疫印跡、免疫組化等方法，檢測單克隆抗體與目標(biāo)抗原的特異性結(jié)合能力，確保其只與目的抗原反應(yīng)，而不與其他無關(guān)抗原交叉反應(yīng)。

抗體親和力鑒定：通過表面等離子共振、生物膜層干涉技術(shù)等方法，測定單克隆抗體與抗原的親和力常數(shù)，評估其結(jié)合的緊密程度和穩(wěn)定性。

抗體效價(jià)測定：采用 ELISA 等方法，測定單克隆抗體的效價(jià)，即抗體的濃度或活性水平，以確定其在實(shí)驗(yàn)或應(yīng)用中的有效性和適用性。

抗體亞型鑒定：采用 ELISA、免疫印跡等方法，確定單克隆抗體的免疫球蛋白類型和亞類，如 IgG、IgM、IgA 等及其亞型，了解其結(jié)構(gòu)和功能特性。