單克隆抗體制備公司生產(chǎn)工藝

日期：2024-12-10 11:13:31

單克隆抗體制備生產(chǎn)工藝主要包括以下步驟：

一、抗原提純與動(dòng)物免疫

抗原準(zhǔn)備：對(duì)抗原的純度要求較高，尤其是初次免疫所用的抗原。如為細(xì)胞抗原，可取個(gè)細(xì)胞作腹腔免疫；可溶性抗原需加完全福氏佐劑并經(jīng)充分乳化，如為聚丙烯酰胺電泳純化的抗原，可將抗原所在的電泳條帶切下，研磨后直接用以動(dòng)物免疫.

動(dòng)物選擇與免疫：一般選擇與所用骨髓瘤細(xì)胞同源的 BALB/c 健康小鼠，鼠齡在 8-12 周，雌雄不限。免疫過程和方法與多克隆抗血清制備基本相同，因動(dòng)物、抗原形式、免疫途徑不同而異，以獲得高效價(jià)抗體為最終目的，免疫間隔一般 2-3 周.

單克隆抗體制備公司

二、骨髓瘤細(xì)胞及飼養(yǎng)細(xì)胞的制備

骨髓瘤細(xì)胞株選擇：如待融合的是脾細(xì)胞，各種骨髓瘤細(xì)胞株均可應(yīng)用，但應(yīng)用最多的是 Sp2/0 細(xì)胞株。該細(xì)胞株生長(zhǎng)及融合效率均佳，且本身不分泌任何免疫球蛋白重鏈或輕鏈.

細(xì)胞狀態(tài)調(diào)整：細(xì)胞應(yīng)選擇處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、細(xì)胞形態(tài)和活性佳的細(xì)胞，活性應(yīng)大于 95％。融合前骨髓瘤細(xì)胞株需先用含 8 - 氮鳥嘌呤的培養(yǎng)基作適應(yīng)培養(yǎng)，在細(xì)胞融合的前一天用新鮮培養(yǎng)基調(diào)細(xì)胞濃度為.

飼養(yǎng)細(xì)胞制備：常用的飼養(yǎng)細(xì)胞為小鼠的腹腔細(xì)胞，制備方法為用冷凍果糖液注入小鼠腹腔，輕揉腹部數(shù)次，吸出后的液體中即含小鼠腹腔細(xì)胞。飼養(yǎng)細(xì)胞調(diào)至，提前一天或當(dāng)天置板孔中培養(yǎng).

三、細(xì)胞融合

細(xì)胞混合：將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，常用比例為 1:4.

加入促融合劑：加入促融合劑聚乙二醇，在其作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞.

稀釋與培養(yǎng)：將融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，分置培養(yǎng)板孔中培養(yǎng) ，培養(yǎng)液的成分對(duì)融合細(xì)胞至關(guān)重要，其中的小牛血清、各種離子和營養(yǎng)成分均需嚴(yán)格配制.

四、選擇性培養(yǎng)與陽性克隆篩選

選擇性培養(yǎng)：采用 HAT 選擇性培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，只有融合的雜交瘤細(xì)胞才能在該培養(yǎng)基中持續(xù)存活一周以上，而未融合的游離 B 細(xì)胞只能存活 3 天而后自行死亡.

陽性克隆篩選：對(duì)每個(gè)含有雜交瘤細(xì)胞集落的生長(zhǎng)孔中的上清液進(jìn)行抗體檢測(cè)，檢測(cè)方法有放射免疫測(cè)定、酶聯(lián)免疫技術(shù)測(cè)定等，篩選出能夠穩(wěn)定分泌特異性單克隆抗體的雜交細(xì)胞.

五、雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)

通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)，一般稀釋至 0.8 個(gè)細(xì)胞 / 孔，按 Poisson 法計(jì)算，應(yīng)有 36％的孔為 1 個(gè)細(xì)胞 / 孔。細(xì)胞培養(yǎng)至覆蓋 0％-20％孔底時(shí)，吸取培養(yǎng)上清用 ELISA 檢測(cè)抗體含量，篩選出高抗體分泌孔，將孔中細(xì)胞再行克隆化.

六、單克隆抗體的大量制備

體外培養(yǎng)法：將篩選出的陽性細(xì)胞株在體外培養(yǎng)，一般應(yīng)用無血清培養(yǎng)基，需用特殊的儀器設(shè)備，如懸浮培養(yǎng)采用發(fā)酵式的生物反應(yīng)器等，培養(yǎng)液中可分離得到單克隆抗體。其培養(yǎng)方式可分為純批式、流加式、半連續(xù)式和連續(xù)式.

動(dòng)物體內(nèi)誘生法：選用 BALB/c 小鼠或其親代小鼠，先用降植烷或液體石蠟行小鼠腹腔注射，一周后將雜交瘤細(xì)胞接種到小鼠腹腔中，通常在接種一周后即有明顯的腹水產(chǎn)生，腹水中富含大量的目的抗體，每只小鼠可收集 5-10ml 的腹水，有時(shí)甚至超過 40ml，但腹水中也含有大量宿主蛋白和少部分宿主抗體，純化難度相對(duì)較大.

七、單克隆抗體的純化

單克隆抗體的純化方法有多種，一般采用鹽析、凝膠過濾和離子交換層析等步驟達(dá)到純化目的，也有采用較簡(jiǎn)單的酸沉淀方法，目前最有效的單克隆抗體純化方法為親和純化法，如用葡萄球菌 A 蛋白或抗小鼠球蛋白抗體與載體交聯(lián)，制備親和層析柱將抗體結(jié)合后洗脫，回收率可達(dá) 90％以上.