cleaved parp1單克隆抗體制備的步驟方法
日期:2023-05-10 14:46:42
PARP1在DNA修復和轉錄調節等生物學過程中發揮重要作用的蛋白質。在細胞凋亡中,PARP1 被激活的半胱氨酸蛋白酶 caspase3 和 caspase7 水解,導致 PARP1 的 N端被裂解,并釋放出具有死亡啟動功能的 24kDa 片段。因此,cleaved PARP1 (裂解的PARP1) 成為了診斷細胞凋亡的重要分子標志物。
單克隆抗體是一種高度特異性、高親和力的蛋白質,很適合用于檢測 cleaved PARP1 的表達。下面將介紹一種制備 cleaved PARP1 單克隆抗體的方法。
1. 免疫原的制備
①收集培養好的人類細胞,如 HeLa 細胞。
②將細胞洗滌并暴露在低滲肝素鹽水(PBS)中。
③使用液氮的冷凍-溶解技術以及機械壓碎法來裂解細胞,得到裂解物的混合物。
④使用蛋白質電泳和透析技術從混合物中純化出 cleaved PARP1,然后用凈化后的蛋白質制備成免疫原。
2. 免疫動物
①給小鼠注射 cleaved PARP1 免疫原。按照以下方式進行注射:首先,將免疫原混合物與免疫佐劑混合,然后經皮下、肌肉或靜脈注射到小鼠體內。
②在一段時間內反復注射免疫原,以便免疫系統能夠產生免疫反應。殺死小鼠并收集其脾臟,以制備免疫球蛋白。
3. 單克隆抗體制備
①從脾臟細胞中分離出單個 B 細胞,該細胞會產生特定的抗體。
②將單個 B 細胞與癌細胞融合,得到雜交瘤細胞。
③將這些雜交瘤細胞在培養基中培養,并篩選出產生免疫球蛋白的雜交瘤細胞。
④對產生的免疫球蛋白進行鑒定,挑選特異性強、抗原親和力高的雜交瘤細胞,以制備單克隆抗體。
以上步驟中,免疫原的制備和免疫動物的免疫過程可能會受到多種因素的干擾,從而導致實驗結果的不準確。因此,為了獲得更精確、可靠的單克隆抗體,需要在實驗設計和操作技術上進行仔細的考慮和調整。
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