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質(zhì)粒提取原理

日期:2010-08-02 13:54:00

        質(zhì)粒是細(xì)胞內(nèi)的一種環(huán)狀的小分子DNA,是進(jìn)行DNA重組的常用載體。作為一個(gè)具有自身復(fù)制起點(diǎn)的復(fù)制單位獨(dú)立于細(xì)胞的主染色體之外,質(zhì)粒DNA上攜帶了部分的基因信息,經(jīng)過基因表達(dá)后使其宿主細(xì)胞表現(xiàn)相應(yīng)的性狀。在DNA重組中,質(zhì)粒或經(jīng)過改造后的質(zhì)粒載體可通過連接外源基因構(gòu)成重組體。

        從宿主細(xì)胞中提取質(zhì)粒DNA,是DNA重組技術(shù)中最基礎(chǔ)的實(shí)驗(yàn)技能。分離質(zhì)粒DNA有三個(gè)步驟:培養(yǎng)細(xì)菌使質(zhì)粒擴(kuò)增,收集和裂解細(xì)菌,分離和純化質(zhì)粒DNA。

        在質(zhì)粒提取過程中,由于機(jī)械力、酸堿度、試劑等的原因,可能使質(zhì)粒DNA鏈發(fā)生斷裂。所以,多數(shù)質(zhì)粒粗提取物中含有三種構(gòu)型的質(zhì)粒:共價(jià)閉合環(huán)狀DNA(cccDNA): 質(zhì)粒的兩條鏈沒有斷裂;超螺旋開環(huán)DNA(ocDNA): 質(zhì)粒的一條鏈斷裂;松弛的環(huán)狀分子線形DNA(lDNA): 質(zhì)粒的兩條鏈均斷裂;線性分子質(zhì)粒DNA的分子構(gòu)型 。

        質(zhì)粒DNA瓊脂塘凝膠電泳模式圖可分為:松弛線性的DNA; 松弛開環(huán)的OC構(gòu)型; 超螺旋的SC構(gòu)型。由于瓊脂糖中加有嵌入型染料溴化乙錠,因此,在紫外線照射下DNA電泳帶成橘黃色。 道中的SC DNA走在最前沿,OC DNA則位于凝膠的最后邊;道中的L DNA 是經(jīng)核酸內(nèi)切限制酶切割質(zhì)粒之后產(chǎn)生的,它在凝膠中的位置介于OC DNA 和 SC DNA 之間。


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