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西北農(nóng)林科技大學(xué)Nature子刊基因組編輯新成果

日期:2013-10-16 09:31:14

來自西北農(nóng)林科技大學(xué)的研究人員成功利用鋅指切口酶zinc-finger nickases,ZFN)介導(dǎo)將溶葡萄球菌素(lysostaphin)基因插入到β-酪蛋白(beta-casein)基因座,由此構(gòu)建出了活產(chǎn)基因靶向性克隆牛。這一突破性的研究成果發(fā)表在1014日的《自然通訊》(Nature Communications)雜志上。

 

領(lǐng)導(dǎo)這一研究的是西北農(nóng)林科技大學(xué)的張涌(Yong Zhang)教授,其多年從事哺乳動物發(fā)育生物工程理論和技術(shù)研究。是國家級“有突出貢獻專家”。

 

ZFN是一種適用于基因組工程操縱、實現(xiàn)定向突變的強有力的工具。ZFNs切割DNA,在基因組中生成位點特異性雙鏈斷裂(DSBs)。或通過非同源末端連接(NHEJ)修復(fù)雙鏈斷裂,往往會在連接斷點導(dǎo)入短的插入或缺失(indels),或是通過同源重組修復(fù)(HDR)拷貝姐妹染色單體忠實地修復(fù)原始序列。盡管非同源末端連接是高等真核細胞和生物體主要的雙鏈斷裂修復(fù)信號通路,目前研究人員利用了這兩種信號通路來實現(xiàn)定點基因組修飾。

 

當(dāng)前,ZFNs被廣泛地應(yīng)用于基礎(chǔ)研究、生物技術(shù)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,但由于不可避免地生成雙鏈斷裂以及非同源末端連接的易出錯性,利用可編程核酸酶進行基因組工程操縱受到限制。并且,這些可編程核酸酶往往會在高度同源的位點誘導(dǎo)出隨機生成及不需要的缺失。而且核酸酶誘導(dǎo)太多脫靶雙鏈斷裂對細胞有害。此外,要正確地分離出基因靶向細胞也不是件容易的事情。

 

克服這些局限的一種潛在策略就是,靶向性導(dǎo)入到包含一個單鏈斷裂(SSB)或切口的DNA中。像雙鏈斷裂一樣,單鏈斷裂/切口理論上可以刺激同源重組修復(fù)信號通路。與雙鏈斷裂相比,切口或SSB不是非同源末端修復(fù)的底物。因此,靶向性SSB有潛力將修復(fù)限定至同源重組修復(fù)信號通路。

 

溶葡萄球菌素可由溶血性葡萄球菌自然生成,已有人提出用它來進行全身性治療溶血性葡萄球菌感染。在小鼠模型中,溶葡萄球菌素已被證實能夠?qū)谷苎云咸亚蚓鸬娜橄傺住S醒芯繄蟮溃橹斜磉_溶葡萄球菌素的轉(zhuǎn)基因牛能夠抵抗溶血性葡萄球菌乳房感染。然而在體外采用哺乳動物細胞生成的溶葡萄球菌素由于糖基化有可能發(fā)生蛋白質(zhì)失活。因此,修改編碼序列生成Gln125,232-溶葡萄球菌素確保了兩個潛在糖基化位點被移除。這可以防止蛋白質(zhì)糖基化并恢復(fù)部分蛋白質(zhì)活性。

 

在新研究中,研究人員的目的旨在通過在牛胚胎成纖維細胞內(nèi)將外源性Gln125,232溶葡萄球菌素基因插入到β-酪蛋白基因座中,進行有效、可重現(xiàn)的基因靶向,從而使得基因靶向牛的乳腺能夠生成溶葡萄球菌素蛋白。

 

研究人員隨后證實了,在牛胚胎成纖維細胞中將ZFNickases靶向內(nèi)源β-酪蛋白基因座,通過同源重組修復(fù)刺激可添加溶葡萄球菌素基因。他們發(fā)現(xiàn),ZFNickase處理細胞可成功用于體細胞核移植,生成了活產(chǎn)的基因靶向牛(gene-targeted cow)。并且,這些基因靶向牛的乳汁中分泌溶葡萄球菌素,體外分析證實這種牛奶能夠殺死金黃色葡萄球菌。研究人員表示,在這一策略上取得的成功將推動新的轉(zhuǎn)基因技術(shù)讓農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)學(xué)獲益。

 

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