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新技術(shù)準(zhǔn)確定量罕見的mtDNA缺失

日期:2013-09-09 09:36:02

Fred Hutchinson癌癥研究中心的研究人員近日發(fā)現(xiàn)了一種新工具,能夠準(zhǔn)確分析與多種疾病和衰老相關(guān)的極罕見線粒體DNA缺失。這項(xiàng)成果在線發(fā)表于《Aging Cell》雜志上。

 

mtDNA突變的積累與衰老、神經(jīng)肌肉疾病和癌癥有著密切的關(guān)聯(lián)。然而,目前的方法無法準(zhǔn)確定量和鑒定新的缺失事件,因其發(fā)生頻率非常低,正常組織中每1億個(gè)線粒體基因組約有一個(gè)缺失事件。為了解決這些限制,研究人員開發(fā)出一種基于ddPCR的分析方法,來高分辨率地分析這些罕見缺失。他們將這種方法稱為“數(shù)字缺失檢測Digital Deletion Detection)”,簡稱3D

 

文章的通訊作者Jason Bielas博士談道:“研究mtDNA突變是極其困難的,更不用說缺失。我們的3D檢測在特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性上與傳統(tǒng)方法相比有了明顯的改善。微滴式數(shù)字PCR所帶來的通量增加讓分析時(shí)間從數(shù)月縮短至數(shù)天。若沒有這一技術(shù),我們無法獲得這一發(fā)現(xiàn)。”

 

Bielas博士指的是Bio-RadQX100 ddPCR系統(tǒng)。利用這一系統(tǒng),研究小組分析了80億個(gè)人類腦mtDNA基因組,并鑒定出超過10萬個(gè)帶有缺失的基因組。他們發(fā)現(xiàn),與流行的看法相反,大多數(shù)mtDNA缺失的增加并不是由新的缺失引起的,而是之前缺失的擴(kuò)增。他們推測,現(xiàn)有突變的擴(kuò)增應(yīng)當(dāng)是造成mtDNA缺失積累的主要因素。

 

3D是一個(gè)新穎的三步法過程,包括富集帶有缺失的分子;基因組被分成單分子液滴,并通過ddPCR定量;利用新一代測序確定斷裂點(diǎn)。

 

富集完成后,通過QX100系統(tǒng)調(diào)整液滴中的分子濃度,讓大多數(shù)液滴不含有突變基因組,而少數(shù)只有一個(gè)。這一過程允許每個(gè)缺失被無偏向地放大,而不會(huì)像qPCR那樣引入誤差。

 

在擴(kuò)增后,Bielas及他的小組利用ddPCR確定突變分子的絕對濃度。根據(jù)液滴熒光和擴(kuò)增子大小之間的關(guān)系,他們能夠鑒定大腦樣品中罕見缺失的大小和復(fù)雜性(到底是幾個(gè)克隆的擴(kuò)增,還是大量隨機(jī)缺失)。

 

研究人員認(rèn)為,3D檢測作為一種重要的新工具,將有助于更好地研究缺失形成和擴(kuò)增的機(jī)制,以及它們在衰老中的作用。而微滴式數(shù)字PCR的高通量和高靈敏度也讓Bielas博士的實(shí)驗(yàn)室能夠靶定骨骼肌、腦組織和血液中其他低水平的致病mtDNA缺失。

 


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