乳腺癌細胞中介導內源性GRB2蛋白網絡的關鍵磷酸化蛋白的鑒定
日期:2013-08-12 09:46:30
在論證了利用重組蛋白可鑒定SH2磷酸化蛋白結構域的相互作用后,美國休斯頓大學的研究人員開始研究在體內檢測磷酸化蛋白質相互作用的可行性。
研究人員開發了一種基于細胞總蛋白測定法在腫瘤細胞中檢測由酪氨酸磷酸化介導的內源性磷酸化的蛋白質相互作用。他們假設,在多肽芯片上的酪氨酸磷酸濃度(在pM或fM范圍內)比在體內的濃度高得多(1–4 µM),這將使磷酸肽能夠捕獲參與磷酸模體的蛋白復合物。
為了測試這一假設,研究人員設計了一款酪氨酸磷酸肽芯片(聯川生物提供多肽芯片技術服務),其具有160個高親和力的SH2結構域,可以結合之前實驗鑒定的磷酸模體包括重組體SH2結構域。芯片上每條多肽探針設置了10次重復,每次重復設置了一條質控多肽。
為了檢測并比較GRB2的磷蛋白相互作用網絡,研究人員采用了磷酸肽綁定試驗分析了4種不同類型的細胞:
非致瘤性上皮細胞(MCF10A)
ER陽性腫瘤細胞(MCF7)
ER陽性腫瘤細胞(T47D)
乳腺轉移性細胞系(MDA-MB231)
細胞裂解物結合實驗方案(a)和預測的細胞總蛋白混合物中相互作用的類型,其中蛋白可能通過各種磷酸酪氨酸結合域和磷酸酪氨酸模體進行相互作用(b)。
掃描芯片后獲得的圖像文件(a),如下圖所示,由酪氨酸磷酸化多肽結合GRB2介導的蛋白復合物的絕對信號測定,可通過GRB2蛋白特異性一抗與隨后結合染料的二抗進行檢測。
采用內部軟件程序對數據進行嚴謹的數據處理,選取與細胞裂解物中內源性GRB2相互作用居前的磷酸肽探針(b)。
共有57個磷酸化肽探針在不同細胞類型中顯示出顯著的相互作用差異(2–3倍),這足以將一個細胞類型從另一個細胞類型中區分開。
幾乎70%的相互作用(40/57)被以前的研究所證實,而其余的是新的未知的相互作用。這支持了研究者對濃度介導磷酸肽蛋白復合物結合的假設。
基于Pepcyber數據庫的預測,24個相互作用是由GRB2直接介導的,17個相互作用或是以直接或是以復合體形式與其他蛋白相互作用,15個相互作用是間接與一個或多個sandwich蛋白作用,這可能會在細胞裂解物中有數千個蛋白質通過不同的磷酸酪氨酸模體進行相互作用的情況下出現。