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檢測小RNA的新方法

日期:2013-01-08 09:44:57

雙光子顯微鏡在實驗生物學中正變得越來越有必要。其應用范圍包括追蹤細胞和亞細胞的運動,監控稀有事件,并記錄小型結構的高速信號。神經元樹突和樹突棘很小,而神經電生理信號又很快,如膜電位或離子濃度的瞬變,這使得這些結構的功能研究必須使用高時空分辨率的記錄方法。

 

在這方面,傳統的雙光子顯微鏡,再加上對生理參數敏感的熒光指示劑,只提供了部分解決方案,帶來了近衍射極限的空間分辨率。這是因為,傳統的雙光子顯微鏡使用相對較慢的束掃描方法,它嚴重限制了功能數據可被記錄的程度。

 

在這篇protocol中,作者詳細介紹了高速雙光子成像系統的發展,并討論了在選擇附加部件時必須考慮的重要因素。作者提到,大部分高速雙光子成像系統在光學設計上類似于傳統的系統,包含四個主要的部件:光源、掃描儀、顯微鏡和檢測器。不過,這些部件的選擇主要取決于所使用的掃描技術。

 

在任何細胞中,RNA種類的數目都是非常復雜的。RNA的大小從20 nt到幾kb不等,且豐度也差異很大,每個細胞中可能只有幾個拷貝,也可能有幾十萬個拷貝。如今大家對于RNA的興趣日益濃厚,希望了解特定RNA物種的豐度和完整性。

 

這篇protocol介紹了一種檢測小RNA的新方法:夾板連接法(splinted ligation)。它的原理是:在互補的“DNA夾板”或“橋梁”寡核苷酸存在時,依靠T4 DNA連接酶將RNA分子的末端3-羥基與DNA鏈經過標記的5-磷酸基團相連,之后可通過變性凝膠電泳和磷屏掃描來觀察。這種方法建議用于特定小RNA(如miRNApiRNA)的常規檢測和定量。

 

作者認為,這種方法在檢測小RNA上比northern blotting要靈敏得多,且操作更快。同時,它也是定量的,可用于比較不同樣品中小RNA表達的水平。

 


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