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全新測序技術利弊比較之單分子測序

日期:2012-07-16 09:49:27

在去年召開的美國微生物學會上,來自明斯特大學的醫學微生物學家Dag Harmsen開始聽到了有關德國大腸桿菌疫情爆發的傳言,這場疫情首先在德國北部地區爆發,感染了至少4000人,奪去了超過50人的生命(德國范圍內),在德國以外的歐洲地區也發現了76名患者。

 

Harmsen教授在這場疫情中發揮了重要的作用——他們通過將引發此次疫情的O104H4型腸出血性大腸桿菌與2001年采集自一名溶血性尿毒癥(HUS)體內的O104H4型腸出血性大腸桿菌進行基因對比后,發現,兩種菌株并非同源,引起此次德國EHEC暴發的O104:H4菌株來自一種腸聚集性大腸桿菌EAEC O104:H4 55989菌株的變異,其中還摻雜了一種目前未知的由志賀毒素產生的O104H4菌株。

 

在這一場“戰役”中,Harmsen教授主要采用的就是新一代測序技術,他說,“至今,新一代測序技術已經遍布全球上百個基因組測序中心”。并且隨著更多更新技術的發展,未來新一代測序技術將發展出下下一代創新技術,為基礎科學與臨床治療提供越來越完善的幫助。近期The Scientist雜志就以“Sons of Next Gen”為題,介紹了目前值得關注的各種新技術。

 

單分子測序

 

Pacific Biosciences公司在20114月向市場推出了他們的一款全新產品:the Single Molecule Real Time (SMRT) 測序儀,這一款儀器與傳統測序儀一樣,也是依賴于熒光標記核苷酸,但是有一點卻不同——SMRT一次只聚焦于一個分子,消減了耗時的擴增步驟。

 

Pacific Biosciences首席科學家Eric Schadt解釋道,這一系統能在15萬個小孔(小孔直徑為幾十納米,蝕刻于一種鋁薄膜上)中捕獲單個DNA分子,以及一個DNA聚合酶,然后將四種熒光基團標記的核苷酸加在上面。當DNA聚合酶將核苷酸加到序列上的時候,利用兩種不同波長的激光束掃描每個小孔,與增長DNA鏈匹配的核苷酸就發出熒光,這時精密的成像儀器就能從光激發顏色中識別出加入DNA鏈的特殊核苷酸。“這樣你就能確實觀察到DNA的一個單分子”,Schadt說。

 

SMRT無需仔細調整多個DNA片段序列——由于錯誤積累,逐漸導致非同步,就可以閱讀非常長的片段,平均可超過3000個堿基對,甚至達到上萬個堿基對。而傳統的測序方法只能達到35-400個堿基對的讀長。

 

這種測序能力對于來自加州大學戴維斯分校的遺傳學家:西蒙·陳(Simon Chan)來說意義重大,他希望能搞清楚端粒中重復的,迅速進化的DNA是否參與了形態變化。在此前一項研究中,陳博士分析了不同類型序列模式,追蹤了新重復重組出現的時間,但是由于每個序列都很相似,因此很難見短DNA片段,精確組裝成正確序列,陳博士說,“現在我們采用了長讀長測序,更全面的了解了這些序列,解決了問題。”

 

但是SMRT的價格并不親民,比較高,這就意味著只有少數幾個大型測序中心能買得起。而且這種儀器的錯誤率也相對比較高,來自Warp Drive BioKeith Robison說,“一個run大約會出現15%”,他分析過幾種測序儀的數據。不過由于出錯是隨機出現的,而SMRT讀長很長,因此可以將DNA片段前后相連,多做幾次獲得比較精確的結果,他表示。

 

Robison認為這種儀器最有利的應用是在單體型分析方面,因為這種研究需要很長讀長,或者從頭測序,而且發生小錯誤也無關緊要。

 


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