最新綜述：超越5種堿基的DNA測序（三）

日期：2012-06-21 08:28:21

在納米孔單分子測序技術中，相關納米孔直徑只允許嚴格線性序列的單鏈DNA通過。納米孔可以是生物源的，如a-溶血素 (aHL) 或MspA蛋白等膜蛋白復合體。也可以由固體材料合成，如氮化硅、氧化鋁、多層石墨烯三明治、單層石墨烯或者碳納米管。納米孔包括一個能區分不同堿基的檢測區域，在堿基穿過納米孔時生成相應的短暫信號。隨后對不同類型的信號進行評估，包括穿過納米孔的電流阻塞、跨越納米孔的隧道電流或者電容改變。

研究顯示，該技術能通過電流信號在固定于aHL 納米孔、MspA孔或穿過氮化硅納米孔的單鏈DNA片段中對5-mC和5-hmC進行區分（圖4）。該技術成功的關鍵是對DNA穿孔轉運的精確控制，在一些研究項目中科學家利用了酶活性來輔助這一技術，如將核酸外切酶或聚合酶放置在納米孔入口附近。研究顯示，使用共價結合了環糊精分子作為檢測讀取頭部的aHL納米孔，結合核酸外切酶，通過檢測殘基的納米孔電流，能夠從自由核苷酸磷酸鹽單體形式的四種標準堿基中區分5-mC。有文章顯示，該技術結合聚合酶，通過檢測DNA復制時模板鏈穿過納米孔產生的電流阻塞差異，能實時監測DNA聚合酶連續添加核苷酸的過程。由于該技術是基于對DNA聚合酶的連續活性進行單分子實時監測來進行測序，可想而知也可以通過與SMRT測序分析聚合酶動力學相同的方式對堿基修飾進行檢測。為了通過單獨監測每個納米孔電信號獲得大量多重分析信息，有文章報道了一種可供選擇的方案，能對多個納米孔進行平行的光學讀取，但這需要將目標DNA序列的每一個核苷酸進行轉化標記上分子信標，而這種樣品制備方法難以應用于檢測堿基修飾。

有研究應用先進的電子顯微鏡技術以單堿基的空間分辨率，對DNA模板分子的遺傳和表觀遺傳學信息進行直接讀取。包括利用透射電鏡（TEM）直接對能唯一地區分不同堿基的原子進行化學檢測。以及用碘和溴等化合物對堿基進行化學標記，以增強檢測能力和對比度。可以想見在未來，能利用顯微鏡直接成像或堿基修飾特異性化學轉化技術對特定堿基修飾進行檢測，如用含可檢測原子的葡萄糖標記5-hmC或帶可檢測鏈的疊氮葡萄糖標記（類似方法見）。

顯微鏡方法成功的一個先決條件是將各DNA分子結合到可靠的基底上。近來有研究將DNA分子轉印到單層石墨烯上（被認為是高分辨率電鏡的最佳基底），通過高分辨率電子束照射和電子能量損失譜分析，成功應用了使這項技術。這種方法隨后被用于檢測5-mC在DNA分子上的分布，該研究依據熒光標記的methyl-CpG結合多肽的結合情況，能對不同甲基化水平的DNA分子進行比較，該方法目前只用于寬場熒光檢測。該文章顯示該方法也能適用于超高分辨率光學顯微鏡或電子顯微鏡技術，以增強空間分辨率。

還有研究報道了使用掃描隧道顯微鏡（STM）對單鏈DNA分子進行成像，通過分析STM 原子針尖、堿基和導電表面之間隧道電流的差異檢測四種堿基。科學家利用該技術得到了已知序列的單鏈DNA分子中的鳥嘌呤“電子指紋”。未來，可能通過這種方法得到其他堿基修飾的電子指紋。

RNA直接測序

人們在RNA分子中發現了更大量的堿基修飾。這些修飾是決定重要代謝過程的結構和調控所必須的，且與疾病發展相關。曾今由于缺少常規高通量的RNA直接測序技術，要在測序水平上進行RNA修飾研究很困難。而繁重非測序分析方法往往缺乏足夠的分辨率，大大限制了RNA堿基修飾研究。重亞硫酸鹽處理也被用于在RNA研究中檢測RNA5-mC甲基化模式。在cDNA合成過程中，特定RNA堿基修飾會引起互補cDNA鏈的堿基改變（如：腺嘌呤-肌苷修飾，肌苷在體外反轉錄中被識別為鳥嘌呤），因此能通過比較cDNA序列和同源基因組序列就能對RNA堿基修飾進行推斷。

有研究描述了基于Helicos方法的RNA直接測序short-read技術，但與DNA測序情況類似，該方法難以應用于檢測RNA堿基修飾。在最近的文章中，通過用一個逆轉錄酶代替DNA聚合酶，研究人員應用SMRT測序直接讀取RNA模板信息，在合成RNA模板和轉染了報告系統的細胞RNA中成功檢測了6-mA。

結論

DNA測序對我們的生物學知識進行了革新，從根本上改變了生物學的研究方式。通過強大的計算方法將廣泛且高效的DNA和cDNA測序，與蛋白質組學、生物分子動力學和大量其他表型信息結合起來，能使生物學研究形成徹底轉變，從而改善人類健康、提高食品和能源供給和加強環境保護。然而迄今為止，測序研究還主要集中在四種標準堿基和5-mC上，而這些研究所提供的DNA結構信息明顯不足。研究顯示大量核苷酸修飾在多種重要生物學過程中起著決定性作用，包括基因表達、免疫力、疾病和致病性。此外，根據近期新堿基修飾的發現速率推斷，很可能功能性相關的DNA化學修飾還沒有完全被發現。