兩個人完成同樣的實時PCR（real-time PCR）實驗有可能得到不同的結果。研究人員正在量化這一差異性以了解它的來源以及如何解決這一問題。

當一個細胞中某個基因的表達增高時，首先衡量的可以是基因與它的最終蛋白質產物的中間分子——信使RNA（mRNA）。對于希望基于健康、環境或內部線索對細胞進行追蹤的科學家們而言，測量mRNA分子的改變是一種追蹤細胞基因上調、下調、開啟或關閉的最好的途徑。

自從20世紀90年代中期以來，逆轉錄定量PCR(RT-qPCR)即成為了追蹤單細胞中mRNA分子濃度的常用方法。然而RT-qPCR的每一步都可能將錯誤引入到實驗中。現在，一些科學家們正試圖退后一步觀察如何能夠通過優化將RT-qPCR應用于研究領域，來改善他們的研究數據。

葡萄牙米尼奧大學微生物學家Nuno Cerca 說。“當前有大量的研究工作針對標準化qPCR方法。然而我認為它仍被低估了。盡管遵循標準化指南，我們可以獲得重現性好的研究結果，但它們并不可靠。”

Cerca提到的現有指南是指MIQE（Minimum Information for Publication of Quantitative Real-Time PCR Experiments）， 簡稱mykee，是一套在國際上最新推出的指導方針，就評價qPCR實驗和發表文章時所必需的實驗信息提出了最低限度的標準。這些指南首次由倫敦大學瑪麗皇后學院的分子生物學家Stephen Bustin領導的研究小組于2009年發布在《臨床化學》雜志（journal Clinical Chemistry）上。該指南提出了研究人員應該納入到他們的qPCR實驗中的一些細節以確保獲得準確的結果。它們被分為四個關鍵領域：樣本質量控制、實驗設計、PCR效率和標準化。

“在同行評審的文獻中MIQE指南現已被引用超過600次，成為了《臨床化學》發表的論文中引用排名第八的文章。因此這一信息已經開始傳播至整個研究群體，”Bustin說。

然而有一些研究人員卻并沒有審核MIQE推薦的優化步驟繼續開展qPCR實驗，并公布他們的研究結果。“我認為這些人并不是不知道這一指南，只不過為了所謂的方便不想遵循它們而已，”加拿大國立科學研究所（INRS）Armand－Frappier 研究所的Cathy Vaillancourt說。

回歸基礎

在加拿大國立科學研究所的實驗室中，Vaillancourt研究了健康孕婦與患有妊娠糖尿病或先兆子癇孕婦的胎盤差異。為了了解這些疾病，Vaillancourt和她的同事們觀察了在不同胎盤中基因表達水平的差異。她們依賴RT-qPCR來定量指定目的基因生成的mRNA量。

去年，Vaillancourt開始利用新型的Bio-Rad實時PCR儀開展一系列的RT-qPCR 實驗。然而當她的兩個學生從事相同的實驗時，他們得到了不同的實驗結果。因此，她開始去了解是什么將差異引入了RT-qPCR實驗中以及研究人員如何能解決這一問題。她很快確定參考基因是她的研究團隊差異性的主要來源。

由于不同的樣本有可能開始有著不同濃度的總RNA，為了控制它研究人員必須依靠參考基因——這些基因被認為在所有細胞中以相同水平表達。如果基于RT-qPCR實驗，在某個組織中一個參考基因水平要高兩倍，那么就意味著研究人員必須將目的基因的濃度減半以確保真實比較相對值。