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Nature Methods:磁測序

日期:2012-04-23 08:57:30

單分子DNA測序取得重要新進展——基于磁鑷的測序檢測技術

 

生物通報道:與以往將熒光標記核苷酸加入到DNA分子,進行直接檢測觀察不同,來自巴黎第七大學的丁方圓(Fangyuan Ding,音譯)等人研發出了一種能檢測DNA發夾分子長度變化的新技術(具體流程見下圖)。相關成果公布在Nature Methods雜志上。

 

如果磁珠相對較大,研究人員就能直接通過簡單配有攝像系統的顯微鏡,直接成像。當引入磁場時,發夾結構被拉伸,解構成一條DNA單鏈。當關閉磁場的時候,發夾結構就能重新折疊形成。隨著磁珠在聚焦點之內和之外漂移,研究人員就能觀測到衍射環,從而精確測量磁珠與玻璃表面的距離。

 

這樣就將十分困難的光學問題(檢測來自單熒光分子的光信號)化難為簡,變成了在亮視場照明下檢測微米級磁珠,從而大大的簡化了光學設備,只需檢測幾種核苷酸順序的長度變化,從DNA發夾到一堿基長的距離。

 

但是從這種發夾長度變化中如何能讀出一條DNA鏈的序列呢?

 

研究人員探索了幾種方法,首先是雜交測序:當研究人員將一個探針與開發發夾結構雜交時,發夾結構就無法完全折疊,這樣就能精確測量到雜交探針的位置。因此當用大量探針一個接一個雜交時,序列就能通過探針重疊的區域讀出來。同時用一套小一些的探針能指紋化DNA序列,比如用于病原體的檢測。

 

然而也許連接綁定測序更為合適,這個概念目前已經在Life Technology公司的SOLiD測序儀中實現商業化了。而在最新這篇文章中,則是指將引物通過結合一個短簡并核苷酸片段進行一步擴增,這種擴增首先是與腺嘌呤為首的片段進行反應,這時只有當對應DNA鏈上的下一個核苷酸是胸腺嘧啶的時候才能進行連接。之后是胞嘧啶為首的片段,再然后是鳥嘌呤和胸腺嘧啶,重復這一周期。

 

在每次連接之后,磁場都會被關閉,從而測量擴增引物的長度。連接上的引物擴增七個堿基,這明顯拉大了表面和磁珠之間的距離,從而能檢測到。接下來連接片段會在位置2上被清楚,這是為了下一輪做準備,以便下一次連接能緊跟在前一輪的前面。

 

新一代測序技術(即第二代測序技術),包括來自RocheLife Technologies,以及Illumina等廠家在內的產品,主要是基于檢測克隆DNA。但是這些系統的讀長受到限制——每一個化學循環過程中,上千個拷貝中總有一些不可避免會無法得到擴增,從而造成失真和錯誤累積,最長讀長目前少于1kb,一般都在100個堿基左右。

 

相反真正的單分子測序方法則未受到這種影響,新技術能簡單排除失誤擴增,而錯誤結果也與讀長無關。實際上目前來自Pacific BiosciencesRS 測序儀已經能達到幾千bp的長度了,但是也存在缺點:較高的錯誤率,這部分是由于單分子熒光信號難以捕捉的問題。

 

因此這篇最新文章的重要性就由此凸顯出來,這種分析單分子的方法無需任何實質上的單分子光學檢測,因此也無需其它系統配備的昂貴的高靈敏度光學儀器。

 


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