孵育一抗

A. 先將需要檢測的抗體準備好，并決定好它們的稀釋度。

B. 配好5%的Milk(TBST溶解)，按要求稀釋好抗體。注意，如需高比例稀釋，最好采用梯度稀釋。

C. 將稀釋好的抗體和膜一起孵育。 一般采用RT 1小時，可根據抗體量和膜上抗原量適當延長或縮短時間。

注意：為了便于后面分析結果，我們一般會選用已確定分子量大小而且純度高的抗體作為marker與一抗同時孵育。

洗滌

用 TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。然后5mins *5。

洗滌是為了洗去一抗與抗原的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺。

孵育二抗

孵育 RT1 小時。 一般采用HRP標記的二抗，稀釋比例為1:5000。二抗的稀釋比例不能太低，否則容易導致非特異性的結合。注意二抗的選擇有多種，要根據一抗來選擇抗兔、抗鼠或者抗羊的二抗，以及根據后面的顯色條件來選擇HRP、AP或者GOD（葡萄糖氧化酶）酶鏈的二抗或者標志其他探針（如核素等）的。

洗滌

用 TBST先快速洗三次，把milk盡快的wash掉。 然后5mins *5。

洗滌是為了洗去二抗的非特異性結合，洗滌的效果直接影響結果背景的深淺，所以洗滌一定要干凈。