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專家解析單分子細胞分析技術(一)

日期:2010-12-30 08:39:06

隨著對細胞生理研究的逐漸深入,科學家們開始解析單個細胞的行為,這是因為即使是同樣的遺傳物質,同樣的周邊環(huán)境,這些細胞還是會朝著不同的方向發(fā)展,有時還會生成不同的功能,而且單個細胞的變化還關系到癌癥,神經疾病等疾病。

然而要分析單個細胞,卻不是那么容易的事情,在基因表達分析中占據主要位置的DNA芯片這種分析方法,由于靈敏度不夠,所以不足以發(fā)現單個細胞水平上的差異,但是從單個細胞中挑選少量RNAs,或者蛋白也不容易做到,而且如果還要分析細胞的動力學因素,那就不只是繁瑣實驗的問題,還需要物理學,機械學,和生物學的多方配合。

來自斯坦福大學的單分子研究專家Stephen Quake研究組在單分子實驗中也遇到了相同的問題,他們希望能檢測相同細胞對于相同信號的反應,之前研究人員已經利用定量PCR進行了批量分析,但是他們還是希望能就單個細胞如何對不同濃度的信號分子TNF-α產生相應的響應進行分析。

細胞信號交流調控著基本的細胞活性以及人體中相應的細胞活動。細胞準確應答周圍環(huán)境的能力是發(fā)育、組織修復和免疫的基礎。深入理解細胞間的相互交流將有助于了解生物系統的復雜性,或能開發(fā)出癌癥,糖尿病及其他自身免疫疾病的新療法。

因此Quake研究組探索出來一種新方法來觀察單一細胞在細胞信號復雜系統中的應答反應,這種方法就是高通量的微流體細胞培養(yǎng)(high- throughput microfluidic cell culture),將這一技術與熒光顯微鏡,定量基因表達分析和建立數學模型等研究手段結合起來,Quake研究組首次發(fā)現相同細胞之間存在大范圍的差異,并且指出了科學家的一些認識可能已經被基于細胞群體研究的結果所誤導。

細胞活化這一結果是一樣的,然而細胞達到結果的過程可能是不一樣的,群體研究不能顯示信息錯綜復雜的信號網絡中的差異,而這在單一細胞水平中可以觀察到。

研究人員利用不同的蛋白濃縮物刺激細胞,這些濃縮物是免疫系統應答炎癥或癌癥反應的代表性物質。結果發(fā)現,一些細胞接受信號并被激活,而一些細胞則沒有激活。研究人員人員觀察到細胞以不同的方式產生應答,但是細胞的基本反應在許多方面是一致的。

這種方法的優(yōu)勢是效率十分高——利用這種方法,研究人員能同時處理成百上千的細胞,并且觀察長達4天的時間里,這些細胞的反應。而缺點就是微流體實驗并不容易操作,因此一定要考慮清楚。如果你希望觀測細胞對于一個信號刺激的反應,那么也許一個96孔板就能搞定,但是如果你希望了解細胞在系列環(huán)境中的反應,那么微流體實驗也許更加合適,具體來說還得看個人的情況。

Quake研究組今年在單分子研究方面還獲得了另外一項重要的成果:他們發(fā)展了一種平價的單分子光譜技術,所謂單分子光譜,其實主要用來研究納米領域,其基本觀念非常簡單:就是一次只觀測一個生物分子或納米粒子,因此可以輕易觀測到很多分子尺度的動態(tài)過程,蛋白質分子折迭(folding)即為一例。為了達到單分子光譜的靈敏度,關鍵之一就是要利用高數值孔徑(numerical aperture, NA)的物鏡來聚焦及收光,然而高NA的物鏡價格相對昂貴,而且還會衍生一些實驗測量上的問題。

為了解決這一問題,以及無法做長時間觀察,觀察視野較小及工作距離較短的問題,研究人員將具有高折射率的二氧化鈦(TiO2)微米球放在單熒光分子及物鏡中間,讓TiO2微米球們扮演微透鏡(microlens)的角色,將熒光分子所發(fā)出的光聚焦至物鏡。這種結合微透鏡及平價低NA(=0.5)物鏡的作法,可偵測單分子訊號而不會有熱效應的問題,因此能做長期觀測。他們利用這項技術成功地在70°C的高溫下,觀察到單一酶的活動過程。


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