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蛋白質純化之離子交換法

日期:2010-09-03 15:54:15

一、儀器設備

1.塑料管柱(Bio-Rad Econo-Pac column 732-1010, 1.5×12 cm)

2.部分收集器(fraction collector, 另需準備干凈試管約60 支)

3.濃縮用離心機(低速5,000 rpm)及濃縮離心管Centriplus

二、藥品試劑

1.DEAE Sephacel (膠體體積約15 mL,預先以緩沖液Buffer A-0 平衡好)

2.Buffer A-0

3.Buffer A-300 溶離液:Buffer A-0 加有0.3 M NaCl

4.Buffer A-500 溶離液:Buffer A-0 加有0.5 M NaCl

三、方法步驟

1.將Econo-Pac 管柱架好,并將三向閥及軟管等組合完成。

2.震蕩DEAE Sephacel 膠體使其懸浮,小心倒入管柱中,讓膠體慢慢沉降,在沉降過程中隨時加入buffer A-0,勿使膠體干掉。

3.待膠體沉降完全后,高度應在15 cm 左右。膠柱以buffer A-0 一直流洗,流速快慢可以不考慮;連接好收集器,每試管收2.5 mL。離子交換法的膠體平衡極為重要,可測流出液的pH 或離子濃度,看是否與buffer A-0 相同,若不一樣則需要再流洗的。

4.樣本的添加方法同上述膠體過濾法,并啟動部分收集器開始收集,當樣本全部沒入膠體后,再加入同體積buffer A-0。以buffer A-0 流洗50 mL 后,去除膠體上方的緩沖液,但勿使膠體干掉。

5.然后依序以buffer A-300, buffer A-500 溶離的,每批次流洗各50 mL,注意更換濃度時,膠體上方勿殘存上一種溶液。

6.收集所有分劃,進行蛋白質定量分析以及GUS 活性測定,結果作圖。

7.收集GUS 活性區,并以Centriprep-30 濃縮至 __ mL (IEX),記得要保留100 μL。

8.離子交換膠體以buffer A-0 洗過50 mL 后,收起來交回。


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