上海交通大學(xué)附屬仁濟(jì)醫(yī)院房靜遠(yuǎn)教授主要從事消化系統(tǒng)腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制、早期診斷和分子治療等相關(guān)研究。近期，該課題組應(yīng)用美國(guó)Arraystar公司的lncRNA芯片分析了胃癌組織的lncRNAs表達(dá)情況，篩選到可預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生的分子標(biāo)志物GClnc1，并且闡明了GClnc1在胃癌的發(fā)生和發(fā)展中是如何發(fā)揮調(diào)控作用的。該研究成果于2016年發(fā)表在國(guó)際著名學(xué)術(shù)期刊Cancer Discovery(影響因子19.783)上。

研究背景

胃癌（GC）是一種常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率在癌癥患者中位列第四。由于早期缺乏特異性癥狀，大多數(shù)患者被診斷時(shí)已經(jīng)處于胃癌晚期。晚期胃癌患者的預(yù)后較差，并最終死于術(shù)后的癌癥復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移。近幾年，科學(xué)家一直致力于尋找用于檢測(cè)早期胃癌或者可以反映個(gè)體患癌風(fēng)險(xiǎn)較高的生物標(biāo)志物，但是收效甚微。非編碼RNAs是一類(lèi)長(zhǎng)度在200nt以上的長(zhǎng)鏈非編碼RNA，研究表明lncRNA的異常表達(dá)和癌癥的發(fā)生有著緊密的聯(lián)系，比如HOTAIR、MALAT1和H19等在癌癥的發(fā)生中都扮演著重要的角色。前期已有文獻(xiàn)報(bào)道lcnRNA在胃癌的發(fā)生中發(fā)揮重要作用，但是其具體的作用機(jī)制還需要進(jìn)一步的探究。

本文的研究目的就是借助lncRNA芯片來(lái)篩選可以用于檢測(cè)胃癌的生物標(biāo)志物，并通過(guò)大量的功能實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證異常表達(dá)的lncRNA是如何調(diào)控胃癌相關(guān)的信號(hào)通路。

研究思路

作者首先檢測(cè)了10個(gè)胃癌病人的胃癌組織和癌旁組織中lncRNA的表達(dá)情況（Arraystar human lncRNA v2.0），借助比較嚴(yán)格的篩選條件（原始信號(hào)值>1500, Foldchange>2以及P-value<0.01）找到了8個(gè)在胃癌組織中表達(dá)顯著增加的候選lncRNAs。接著擴(kuò)大樣本進(jìn)行RT-PCR驗(yàn)證，從而鎖定了其中的4個(gè)lncRNAs進(jìn)行后續(xù)的研究。

接下來(lái)，作者對(duì)這4個(gè)lncRNAs做了臨床分析（KM和ROC曲線(xiàn)），發(fā)現(xiàn)只有lncRNA BC041951的異常表達(dá)和胃癌是顯著相關(guān)，并且BC041951的表達(dá)量從正常胃組織到胃癌的四個(gè)階段是逐漸增加。因此，推測(cè)lncRNA BC041951可以作為預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生的生物標(biāo)志物，并進(jìn)行后續(xù)的功能和機(jī)制研究，同時(shí)將lncRNA BC041951命名為GClnc1。

為了進(jìn)一步探究GClnc1和胃癌的關(guān)系，作者做了一系列的生物信息學(xué)分析以及功能性實(shí)驗(yàn)。作者先將GClnc1敲除，然后借助RNA-seq來(lái)篩選GClnc1可能調(diào)控的基因。通過(guò)RNA-seq找到異常表達(dá)的基因后進(jìn)行基因集富集分析（GSEA），發(fā)現(xiàn)GClnc1調(diào)控的基因中大部分都是癌相關(guān)基因，比如c-MYC和CDK1等。同時(shí)，功能性實(shí)驗(yàn)也證明GClnc1可以促進(jìn)癌細(xì)胞的增殖和入侵，最后促進(jìn)胃癌的發(fā)生。

lncRNAs可以通過(guò)和轉(zhuǎn)錄因子或者其他細(xì)胞因子結(jié)合來(lái)發(fā)揮功能。為了探究GClnc1具體的作用機(jī)制，作者利用RNA pull down實(shí)驗(yàn)和質(zhì)譜來(lái)尋找GClnc1可能結(jié)合的蛋白。通過(guò)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)，作者鑒定了近200個(gè)蛋白，同時(shí)選取了其中的10個(gè)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)的蛋白進(jìn)行WB驗(yàn)證。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，只有蛋白WDR5和KAT2A可以和GClnc1特異性結(jié)合，其中WDR5是H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶，而KAT2A是H3K9乙酰轉(zhuǎn)移酶。接下來(lái)，作者利用siRNA和RIP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了GClnc1可以特異性和蛋白WDR5以及KAT2A結(jié)合形成復(fù)合物。

為了驗(yàn)證GClnc1是否可以調(diào)控蛋白WDR5和KAT2A在全基因組的結(jié)合位點(diǎn)，作者借助ChIP-seq和RNA-seq實(shí)驗(yàn)做了進(jìn)一步的驗(yàn)證（GClnc1 shRNA VS control shRNA）。結(jié)果表明，GClnc1敲低后會(huì)導(dǎo)致蛋白WDR5和KAT2A在全基因組上的結(jié)合能力下降，進(jìn)而使得相應(yīng)基因的表達(dá)水平也會(huì)受到抑制。因此，作者推測(cè)GClnc1做為WDR5和KAT2A形成復(fù)合物的支架來(lái)調(diào)控兩個(gè)蛋白對(duì)于組蛋白的修飾能力，進(jìn)一步調(diào)控基因的表達(dá)和生物學(xué)功能。

根據(jù)ChIP-seq和RNA-seq數(shù)據(jù)，作者發(fā)現(xiàn)超氧化物歧化酶SOD2是WDR5和KAT2A復(fù)合物的一個(gè)靶基因，并且根據(jù)CNC分析發(fā)現(xiàn)SOD2和GClnc1之間也具有高度相關(guān)性（正相關(guān)）。作者分析了GClnc1和SOD2在基因組上的位置關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GClnc1的部分序列和SOD2的3’端的最后一個(gè)外顯子重疊，并且經(jīng)過(guò)生信分析發(fā)現(xiàn)兩者之間不存在共同的miRNA結(jié)合位點(diǎn)。作者接著做了一系列的功能實(shí)驗(yàn)（GOF/LOF）來(lái)驗(yàn)證GClnc1以及SOD2的生物學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)GClnc1確實(shí)可以通過(guò)調(diào)控SOD2來(lái)促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。作者接下來(lái)的目的就是研究GClnc1是如何調(diào)控SOD2來(lái)發(fā)揮生物學(xué)功能的。

作者推測(cè)H3K4me和H3K9A可能調(diào)控基因SOD2的轉(zhuǎn)錄。RT-PCR和Westernblot實(shí)驗(yàn)也表明敲低WDR5或KAT2A可以減弱由GClnc1誘導(dǎo)的SOD2表達(dá)水平的上調(diào)。這就表明WDR5、KAT2A和GClnc1可能共同調(diào)控SOD2的表達(dá)（通過(guò)調(diào)控SOD2啟動(dòng)子組蛋白修飾）。接下來(lái)作者就對(duì)此進(jìn)行了驗(yàn)證，ChIP實(shí)驗(yàn)表明WDR5和KAT2A可以直接結(jié)合在SOD2的啟動(dòng)子區(qū)域，并且發(fā)現(xiàn)敲低WDR5、KAT2A或GClnc1都會(huì)顯著降低另外一種蛋白在SOD2上的結(jié)合能力，說(shuō)明GClnc1在調(diào)控WDR5/KAT2A和SOD2啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合過(guò)程中扮演著重要角色。作者進(jìn)一步證明在SOD2啟動(dòng)子區(qū)域存在H3K4me3和H3K9Ac，并且改變GClnc1的表達(dá)水平，H3K4me3和H3K9Ac的豐度也會(huì)發(fā)生變化。ChIRP分析顯示GClnc1直接結(jié)合在SOD2的啟動(dòng)子區(qū)域。

上述研究表明GClnc1可以做為一個(gè)支架把組蛋白修飾酶WDR5和KAT2A招募至SOD2的啟動(dòng)子處，從而激活該基因的轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而促進(jìn)胃癌的發(fā)生和發(fā)展。

研究意義

本研究借助美國(guó)Arraystar公司的human lncRNA array在胃癌中篩選到大量異常表達(dá)的lncRNA，臨床分析發(fā)現(xiàn)lncRNA GClnc1可以做為預(yù)測(cè)胃癌發(fā)生的生物標(biāo)志物。接著，作者還做了大量的生信分析和功能實(shí)驗(yàn)來(lái)探究GClnc1是如何促進(jìn)胃癌發(fā)生和發(fā)展的。總之，GClnc1可以做為治療胃癌的一個(gè)潛在靶點(diǎn)；并且本研究的芯片數(shù)據(jù)對(duì)胃癌的診斷和治療，以及探究非編碼RNA的分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。