科學家開發新的CRISPR系統——可調、可逆的一步式基因表達控制
日期:2016-12-26 16:15:42
控制基因表達水平的能力,是生物學中的一個主要任務。一種廣泛使用的方法是刪除一個感興趣的非必須基因(Knockout),或者多步重組讓一個感興趣的基因表達減少(Knockdown)。然而,這些遺傳學方法是費時費力的,并且對于定量研究來說是有限的。12月20日,在Nature子刊《Scientific Reports》發表的一項研究中,來自加州大學圣地亞哥分校的研究人員,報道了一種可調的CRISPR-cas系統——tCRISPRi,用于基因表達的精確和連續的滴定測量。
CRISPR-Cas是原核生物中RNA介導的一種免疫系統,它是由CRISPR和CRISPR相關蛋白Cas組成的。根據它們的進化關系主要有三種類型的CRISPR-Cas系統。在化膿性鏈球菌II型CRISPR-Cas系統中,大的單蛋白Cas9 具有RuvC樣和HNH核酸內切酶結構域,負責靶DNA的切割以引起雙鏈斷裂。在HNH和RuvC樣核酸酶結構域具有突變的核酸酶缺陷型Cas9(dcas9),不能切割DNA。相反,dCas9可緊密結合靶DNA,從而影響轉錄。dcas9可以瞬時或穩定地控制基因表達的水平,而不改變基因序列本身。最近開發的一種合成系統,可在體內減少RNA的加工步驟。Cas9的這些特性使其成為CRISPR介導的干擾 (CRISPRi) 的一種有力的工具。
同時,CRISPR Cas9用于基因組DNA編輯和基因調控的精度和通用性是強大的,許多CRISPR Cas9系統被Cas9的組成型表達引起的毒性所阻礙。原則上,這個問題可以通過在一個理想的可誘導和可調節的啟動子下表達Cas9而得以解決。這將允許我們以一種劑量依賴性的模式,對Cas9的表達水平進行精確調控。不幸的是,許多常用的細菌誘導型啟動子所起的作用是“開/關”開關,并缺乏一個變阻器樣的功能來允許這種可調的基因表達。最近,有研究人員在一個木糖誘導型啟動子下表達了dcas9,來敲除枯草芽孢桿菌中的必需基因,并基于功能分析表征了必需基因的網絡結構。
將CRISPR -(d)Cas9系統用于高通量實驗的另一個實際問題是,構建sgRNA用于靶定新基因的過程是費時費力的。目前用于sgRNA構建的方法主要依靠基于質粒的分子克隆技術,其次是轉化。然而,質粒通常存在于多個副本中,因此當需要精確量化時它們就不太理想。質粒也含有自己的基因,并需要通過藥物選擇得以維持。因此,多拷貝質粒為基礎的系統可能會抑制一般細胞的生長和基因表達,并且對細胞生理產生顯著影響。
在這項研究中,研究人員開發了一種可調的CRISPRi (“tCRISPRi”),它可以對大多數的必需和非必需基因實現30倍的抑制。研究人員還設計了細菌基因組,這樣PBAD啟動子就能夠以一種劑量依賴性系統被阿拉伯糖誘導,而在缺乏阿拉伯糖的情況下沒有表現出最小泄漏的雙峰表達。根據外部添加的阿拉伯糖,dCas9的表達是以一種線性的方式進行回應。重要的是,這個品系只需要一個單鏈寡核苷酸重組步驟,就可以將想得到的sgRNA插入到染色體,以允許它的組成型表達。
這些結果表明,tCRISPRi與重組相結合,為基因表達的控制提供了一種簡單和易于操作的工具,并且非常適合于單個sgRNA和高通量可調的knockdown文庫的構建。