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CRISPR先驅Cell子刊發表新成果

日期:2016-09-06 09:10:55

 細菌利用CRISPR RNAcrRNAs)指導的監視復合體,來靶定要破壞的外源核酸。雖然大多數I型和IIICRISPR系統需要四個或更多的不同蛋白質,才能形成多亞基的監視復合體,但是,I-C型系統只使用三個蛋白質來實現crRNA成熟和雙鏈DNA的靶標識別。

 

91日,Cell子刊《Molecular Cell》在線發表的一項研究中,加州大學伯克利分校的研究團隊表明,上述每個蛋白質都發揮著多重的功能和結構作用:Cas5c切割pre-crRNAs并招募Cas7定位RNA向導,以用于經由Cas8cDNA結合和解旋。研究人員采用冷凍電子顯微鏡技術,獲得了Cascade/I-C 監視復合體的自由形式和DNA結合形式的重建結構,所揭示的構象變化可使得形成R環,每一條DNA鏈都有不同的定位。這種精簡的I-C型系統解釋了CRISPR通路如何可能進化出結構緊湊,保留其作為RNA引導性DNA捕獲平臺的全部功能。

 

這篇論文的通訊作者是基因組編輯技術變革的先驅之一Jennifer A. Doudna教授,她曾因這一技術獲得了“生命科學突破獎”( Breakthrough Prize)(欲戴王冠,必承其重:追尋CRISPR奧秘的女科學家),同時也是CRISPR專利的有力競爭者(CRISPR發明專利究竟花落誰手?)。

 

Doudna帶領的研究團隊取得了諸多令人側目的CRISPR研究成果。去年十月,Doudna及其同事在Nature雜志上發表文章指出,Cas9 HNH核酸酶結構域構象狀態直接控制了DNA切割活性。他們通過分子內熒光共振能量轉移(FRET)實驗,鑒定了HNH核酸酶結構域的一種激活構象。研究還證實,一個α-螺旋將HNH的構象改變傳達給RuvC結構域,激活它實現DNA切割。

 

今年年初,Doudna團隊揭示了CRISPR-Cas9準備剪切DNA時的關鍵分子結構。在CRISPR-Cas系統中,Cas蛋白與小CRISPR RNAcrRNA)形成復合體,切割與RNA互補的外源DNAR-loopI型和 IICRISPR-Cas的一個典型特征,基因組編輯常用的sgRNA就會和Cas9形成R-loop。為了闡明R-loop的作用,研究人員通過冷凍電鏡獲得了釀膿鏈球菌Cas9 R-loop的高分辨率結構。

 

四月份,Doudna團隊在細菌中發現了一種CRISPR相關的非經典ArgonauteArgonaute蛋白是真核生物RNAi的關鍵效應子,它也參與了原核生物的基因組防御。Doudna及其同事證實,CRISPR相關Argonaute具有與眾不同的特異性。

 

五月份,Doudna團隊在Molecular Cell雜志上發表文章,揭示了CRISPR介導免疫記憶的一個重要機制。已知CRISPR-Cas的外源序列插入受到嚴格調控,整合在CRISPR前導序列(富含AT)的末尾。Doudna及其同事發現,大腸桿菌E. coli獲取外源序列需要蛋白IHFintegration host factor)。IHF結合前導序列并且誘導DNA彎曲,允許Cas1-Cas2整合酶催化外源序列插入。這項研究表明,CRISPR前導序列在外源序列捕獲中起到了重要的作用。

 


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