對于de novo人類基因組序列組裝而言，短讀長簡直意味著不可能的任務(wù)。不過，加州大學(xué)舊金山分校、BioNano Genomics和10X Genomics的研究人員近日開發(fā)出一種新的組裝方法，它將short-read測序與10X的linked-read測序相結(jié)合。這項成果于近日發(fā)表在《Nature Methods》上。

如今，測序人類基因組已并非難事，但如果要獲得高質(zhì)量的基因組序列組裝，人們必須克服三大挑戰(zhàn)：1) 幾乎100%相同的重復(fù)序列，它們存在于大多數(shù)高等真核基因組中；2) 二倍體的DNA；3) 缺乏能夠產(chǎn)生準(zhǔn)確的長讀取的低成本測序平臺。

去年，西奈山伊坎醫(yī)學(xué)院的Matthew Pendleton去年開發(fā)出一種方法，將Illumina測序、PacBio測序和BioNano Genomics的基因組作圖相結(jié)合，對HapMap樣品NA12878進行了高質(zhì)量的組裝。不過，這種方法的缺點在于PacBio測序的成本相對較高，通量較低。

于是，加州大學(xué)舊金山分校的Pui-Yan Kwok及其同事用10X Genomics的linked-read數(shù)據(jù)取代了Pacific Biosciences的long-read序列。在一項試驗性研究中，他們利用這種方法來測序和組裝HapMap項目的個體基因組，看看效果如何。

這種新方法主要依靠兩個平行過程。首先，利用SOAPdenovo短寡核苷酸分析軟件將Illumina的序列組裝成scaffold。為了讓這些scaffold有序排列成更長的片段，研究人員調(diào)入10X GemCode平臺所產(chǎn)生的序列數(shù)據(jù)，并利用fragScaff來產(chǎn)生新的scaffold。同時，他們利用BioNano Genomics的Irys系統(tǒng)來產(chǎn)生序列motif的物理圖譜，之后結(jié)合10X scaffold來產(chǎn)生最終的混合組裝圖譜。然后，他們利用10X Long Ranger軟件對混合組裝的scaffold進行分相，并借助BioNano Genomics的圖譜來分辨一些重復(fù)區(qū)域。

在試驗性研究中，研究人員利用這種方法對人類HapMap樣品NA12878進行組裝和分相。最初的Illumina組裝產(chǎn)生了超過14,000個scaffold，而N50為0.59 Mb。在混合組裝后，scaffold數(shù)量降為170個，而N50大小達到33.5 Mb，相對之前有57倍的改善。

與參考基因組相比，研究人員發(fā)現(xiàn)他們的組裝結(jié)果比2011年發(fā)表的ALL-PATHS組裝更準(zhǔn)確，與Pendleton等人的方法有95.2%相似。此外，他們還指出，95.7%的外顯子存在于他們的新組裝中。

盡管Kwok及其同事認(rèn)為這種方法是一種改進，但也存在一些局限。例如，10X的方法依賴于高分子量DNA的制備，這對長期保存的樣品而言很難做到。另外，linked-read是通過50-100 kb分子的隨機k-mer擴增產(chǎn)生的，但這些分子不一定北擴增。因此，人們需要產(chǎn)生不同大小的多個測序文庫，這增加了工作量。

“通過這個原理驗證研究，我們證明了使用這三組互補的作圖-測序數(shù)據(jù)能克服之前的限制，而普通實驗室可在短時間內(nèi)以合理的成本平行生成這些數(shù)據(jù)，”作者在文中寫道。