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CRISPR基因敲除、CRISPRi與shRNA,誰更勝一籌?

日期:2016-05-11 09:29:36

 來自荷蘭癌癥研究所的研究人員通過鑒別必需基因,驗證了CRISPR基因敲除篩查優(yōu)于短發(fā)夾RNA(shRNA)CRISPR干擾(CRISPRi)。這項研究工作發(fā)布在近期的《自然生物技術》(Nature Biotechnology)雜志上。

 

功能性遺傳篩查為研究領域提供了許多有價值的信息,在腫瘤學領域它被利用來鑒別診斷標記物和治療靶點,或是在病毒學中用于鑒別對于病毒成功入侵和/或繁殖至關重要的宿主細胞因子。大規(guī)模的基因擾動通常是借助于RNA干擾(RNAi)來實現,但這種方法受限于混亂的脫靶活性及易變的基因敲落效率。盡管利用多種載體來靶向同一基因可以部分程度上減輕這些不利之處,其仍然難以構建出有效及可靠的全基因組文庫。

 

近年來,科學家們改造原核生物的免疫系統(tǒng)CRISPRCas9使之適用于哺乳動物細胞,使得人們現在能夠利用它在培育人類細胞中輕松、有效及經濟實惠地完成基因組編輯。在首次應用于人類細胞后不久,這一系統(tǒng)還被用來完成以往借助于shRNA的全基因遺傳篩查,并通過深度測序來檢測包含特異單向導RNA(sgRNA)序列的細胞的命運。

 

近期一種叫做CRISPRi的方法利用了無酶活性的Cas9 (dCas9)融合KRAB轉錄抑制結構域,CRISPRi不切割靶基因,而是在dCas9靶向轉錄起始位點(TSS)時降低靶基因的表達。利用測序來讀取sgRNA的相對富集/或耗竭,這一技術也被應用于全基因組范圍內調查基因功能。

 

盡管眾所周知,脫靶效應和易變的打靶效率限制了基于shRNA的遺傳篩查,CRISPR/CRISPRi方法是否能夠避開這些問題,由此提供優(yōu)越的功能性遺傳篩查仍然是一個問題。一些評估CRISPR技術脫靶活性程度的初期研究工作明確顯示存在一些脫靶效應,而另一些研究報告則認為這些有可能是有限的。

 

對于細胞生命必不可少的基因可作為一個有用的集合來比較不同篩查平臺的相對性能。不論在何種環(huán)境下,有效地抑制這些基因預計將是致命的。近期,Hart等通過在成百上千的全基因篩查中挑選出一致耗盡的shRNA載體,構建出了必需基因的標準清單。同樣,通過選擇顯示一致低水平表達及在敲低時不影響表型的基因,挑選出了一系列非必需基因。

 

在這篇Nature Biotechnology研究報告中,研究人員稱他們挑選出了預期具有非常一致表型的46個必需基因和47個非必需基因,通過實驗完成必需和非必需基因篩查,比較了基于CRISPR/ Cas9CRISPRi的系統(tǒng)和傳統(tǒng)基于shRNA的系統(tǒng)。他們發(fā)現CRISPR技術最優(yōu),具有低噪音,最小的脫靶效應以及試劑間一致的活性。

 


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