血液中的寶藏:細(xì)胞外RNA
日期:2016-04-28 08:46:13
血液是唯一與所有器官都有接觸的組織,攜帶著有關(guān)機(jī)體的大量寶貴信息。在理論上,檢測(cè)血液攜帶的 DNA、RNA、囊泡和細(xì)胞殘骸可以幫助人們?cè)\斷和監(jiān)控各種疾病。產(chǎn)前基因篩查是血液檢測(cè)的一個(gè)重要應(yīng)用,不過其他循環(huán)生物學(xué)指標(biāo)正在受到越來(lái)越多地關(guān)注,比如甲基化、RNA、微囊泡和外泌體。為了幫助大家更好的分析甲基化、分離囊泡、提取RNA、存儲(chǔ)樣本和分析數(shù)據(jù),The Scientist雜志最近與多位專家學(xué)者探討了檢測(cè)不同血液生物學(xué)指標(biāo)的策略,貢獻(xiàn)出了相應(yīng)的注意事項(xiàng)和實(shí)驗(yàn)技巧。
研究者:加州大學(xué)圣地亞哥分校副教授Louise Laurent,美國(guó)轉(zhuǎn)化基因組研究所副教授Kendall Van Keuren-Jensen
研究項(xiàng)目:鑒定胎盤功能障礙(Laurent)和大腦損傷(Keuren-Jensen)的循環(huán)miRNA指標(biāo)
研究背景:近年來(lái),人們?cè)谘獫{或血清樣本中成功檢測(cè)到了疾病相關(guān)的RNA(exRNA)。這些細(xì)胞外RNA可以成為非侵入性的疾病診斷指標(biāo),這是RNA檢測(cè)最有前景的發(fā)展方向之一。在多種細(xì)胞受到破壞的疾病中(比如大腦損傷),循環(huán)miRNA是非常重要的生物學(xué)指標(biāo)。研究這些miRNA的團(tuán)隊(duì)很多,可供選擇的實(shí)驗(yàn)方案也不少,不過研究者們還沒有就此達(dá)成一致。Laurent和Keuren-Jensen都是美國(guó)NIH細(xì)胞外RNA交流協(xié)會(huì)的成員,他們正在努力推動(dòng)循環(huán)miRNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)化,提升細(xì)胞外RNA研究的可重復(fù)性。
胎盤囊泡:在妊娠期間,胎盤會(huì)將包含RNA的囊泡釋放到母體血液中。Laurent希望從中鑒定胎盤疾病的miRNA指標(biāo),比如子癇前期和宮內(nèi)生長(zhǎng)受限。她和同事正在優(yōu)化自己開發(fā)的方法,從外泌體和微囊泡提取miRNA并分析相關(guān)數(shù)據(jù)。初步研究結(jié)果顯示,母體血液中的外泌體和微囊泡都可以分離出妊娠特異性miRNA。妊娠后期的miRNA指標(biāo)與胎盤組織的關(guān)系尤為密切。
大腦撞擊:Van Keuren-Jensen團(tuán)隊(duì)將監(jiān)控撞擊數(shù)據(jù)的感應(yīng)器裝在橄欖球運(yùn)動(dòng)員的頭盔中,并在橄欖球賽季中收集運(yùn)動(dòng)員的血液、尿液和唾液樣本。他們對(duì)這些樣本進(jìn)行RNA測(cè)序,尋找與撞擊數(shù)據(jù)有關(guān)的生物學(xué)指標(biāo)。研究人員使用了一系列商業(yè)化試劑盒,并且對(duì)細(xì)胞外RNA收集方法進(jìn)行了比較。“使用不同的試劑盒或分離方法會(huì)造成很大的差異,”Van Keuren-Jensen說(shuō)。“現(xiàn)在還很難斷言哪種試劑盒最好。”
注意事項(xiàng):有些測(cè)序試劑盒使用帶“粘性”末端的短片段DNA來(lái)結(jié)合要擴(kuò)增的目標(biāo)分子。這些末端(被稱為接頭)可能給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來(lái)很大的變數(shù)。有些試劑盒產(chǎn)生的接頭二聚體比較少,但測(cè)序偏好比較大。有些試劑盒提供的接頭更隨機(jī)化,可能與某些miRNA結(jié)合得更好。“這些因素會(huì)使結(jié)果產(chǎn)生較大差異,導(dǎo)致難以重復(fù)的結(jié)果,”Van Keuren-Jensen說(shuō)。
實(shí)驗(yàn)技巧:Laurent指出,減少樣本批次、盡量由同一個(gè)人操作有助于降低結(jié)果的差異性。使用內(nèi)參(比如不受疾病影響的一種RNA)是提高結(jié)果可重復(fù)性得另一條途徑。在沒有一個(gè)通用標(biāo)準(zhǔn)的情況下,“設(shè)立內(nèi)參可以幫你去除產(chǎn)量或批次差異帶來(lái)的許多影響,”Laurent說(shuō)。Van Keuren-Jensen建議大家在論文中分享自己所用的試劑盒和分離方法,因?yàn)檫@些信息對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的重復(fù)很有幫助。
監(jiān)控exRNA只需要采集血樣,不像腫瘤活檢那么有風(fēng)險(xiǎn),成本也比較低。不過從血漿或血清中分離exRNA仍有一定的挑戰(zhàn)性,一方面是因?yàn)?/span>exRNA豐度低,另一方面是因?yàn)檠褐械奈廴疚飼?huì)抑制PCR。商品化的試劑盒能簡(jiǎn)化和加速exRNA提取過程,已成為循環(huán)exRNA研究不可缺少的工具。然而很少有人橫向評(píng)估這些試劑盒的提取效率如何,是否能去除血漿中的污染物,是否會(huì)偏向特定的RNA。而這類評(píng)估對(duì)于結(jié)果解釋和實(shí)驗(yàn)之間的比較都很關(guān)鍵。
于是,美國(guó)愛因斯坦醫(yī)學(xué)院的研究人員評(píng)估了市場(chǎng)上7種常用的exRNA提取試劑盒,分別來(lái)自貝克曼•庫(kù)爾特、Life Technologies、Exiqon、Zymo、QIAGEN公司。他們具體評(píng)估了合成RNA的總體回收率、不同大小的合成RNA的回收能力、exRNA產(chǎn)量和純度,以及純化后的擴(kuò)增效率。研究結(jié)果發(fā)表在《BioTechniques》雜志上。
早期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)是無(wú)癥狀的,并且很難檢測(cè)到,因?yàn)槟壳皼]有可用的NSCLC血液測(cè)試。最近,在Cell子刊《EBioMedicine》發(fā)表的一項(xiàng)研究中,南京大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院的張辰宇教授和南京大學(xué)附屬金陵醫(yī)院的張春妮教授帶領(lǐng)的研究小組,確定了一組(五個(gè))血清microRNA(miRNA),作為NSCLC診斷的潛在生物標(biāo)志物。