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PCR、qPCR、dPCR你需要知道的事兒

日期:2016-04-19 09:10:12

 上世紀八十年代Cetus Corporation公司的化學家Kary Mullis發明了PCR,如今DNA擴增儼然已經成為了生物學研究的基礎。三十多年以來,人們為了解決研究中出現的新問題新需求,不斷對這一經典技術進行改良。從經典PCR、實時定量PCR再到現在的數字PCRPCR技術在不斷蛻變卻從未淡出我們的視野。如今PCR技術早已走出實驗室,在遺傳學鑒定和疾病診斷中發揮著巨大的作用,在越來越廣闊的領域里煥發著新的活力。

 

PCR方法大比拼

 

PCR的原理在這里無庸贅述。多年來,研究者們已經在此基礎上開發了一系列衍生技術。目前的PCR方法主要可以分為三類:終點PCRqPCRdPCR

 

終點PCR

 

終點PCR是最原始、最簡單的PCR方法,如今仍在被我們廣泛使用。使用者只能在PCR反應結束之后,通過凝膠電泳、毛細管電泳等方法對產物進行檢測。終點PCR本身是無法定量的,因為該反應產出的DNA量不一定能反映最初情況。舉例來說,不同樣品和序列的擴增效率是有差異的。

 

qPCRdPCR

 

研究者們通過兩種途徑克服了PCR定量分析的挑戰:實時定量PCRqPCR)和數字PCRdPCR)。qPCR主要是利用插入性染料或熒光探針(比如TaqMan),人們可以通過監控PCR過程中的熒光強度比較多個樣品的DNA水平。數字PCRdPCR)的基本工作原理很簡單,先將樣品劃分為多個PCR反應,每個反應最多只含有一個模板。然后通過計數正負反應來確定初始樣品中模板分子的數量。生物通 www.ebiotrade.com

SYBR® Green是一種在qPCR中廣泛使用的插入性DNA染料。隨著PCR循環的連續進行,這種染料的熒光強度會不斷增強,從而可以使人們對反應中的DNA進行定量。SYBR Green法比探針法成本低,使用也更為方便。不過這種方法也存在著與生俱來的弊端,SYBR Green方法產生的非特異性產物較多,會導致高背景和假陽性。盡管如此,這一久經考驗的技術仍然頗為流行,許多研究人員都是SYBR Green法的忠實擁護者,愿意接受這個技術的小瑕疵。

 

雖然qPCRdPCR都能夠對樣品中的核酸進行定量,但它們有一個重要的差別。qPCR只能實現相對定量(比如樣品A的靶序列是樣品B的兩倍),除非用標準品生成一個標準曲線。而數字PCR本身就是絕對定量的,不需要做標準曲線。另一方面,qPCR技術更為成熟名頭也更響,市面上有大量的商業化產品可供選擇。dPCR目前還是個小鮮肉,應用沒有qPCR那么廣泛,價格也更昂貴一些。與dPCR相比,qPCR更適合高通量分析,而且動態范圍很寬。

 

dPCR一般來說更為精確。qPCR能夠輕易分辨兩倍的濃度差異(比如5拷貝和10拷貝),但在微小差異面前比較無力。而dPCR在理論上能鑒別差異小于20%的拷貝數,比如5拷貝和6拷貝。這種精確性在有些方面特別有幫助,比如定量涉及染色體重排的基因拷貝數,或者定量癌癥患者血液中的循環生物學指標。由于dPCR分液相當于稀釋樣品,而且在反應結束時讀取數據,dPCRqPCR更能抵抗抑制劑。

 

重組酶聚合酶擴增RPARecombinase Polymerase Amplification)被稱為是可以替代PCR的核酸檢測技術。RPA主要依賴于三種酶:能結合單鏈核酸(寡核苷酸引物)的重組酶、單鏈DNA結合蛋白(SSB)和鏈置換DNA聚合酶。該反應的最適溫度在37°C - 42°C之間,無需變性在常溫下即可進行,這無疑能大大加快擴增速度。RPA檢測的靈敏度也很高,能夠將痕量的核酸(尤其是DNA)模板擴增到可以檢出的水平,從單個模板分子得到大約1012擴增產物。RPA用不著復雜的樣品處理也不需要溫控設備,適合無法提取核酸的實地應用,真正實現便攜式的快速核酸檢測。英國公司TwistDx IncRPA為基礎開發了TwistAmp® 核酸擴增產品,能夠在15分鐘內進行常溫下的單分子核酸檢測。

 


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