RNA引導(dǎo)的Cas9核酸酶，被廣泛用來設(shè)計(jì)各種細(xì)胞和生物的基因組。盡管Cas9能夠誘導(dǎo)有效的突變發(fā)生，但是脫靶效應(yīng)提高了人們對(duì)于系統(tǒng)特異性的擔(dān)憂。最近，有研究人員開發(fā)出了一種 “雙切口（double-nicking）”策略，利用催化突變體Cas9D10A切口酶，將脫靶效應(yīng)降至最低。4月15日，在Nature子刊《Scientific Reports》發(fā)表的一項(xiàng)研究中，來自英國(guó)劍橋大學(xué)和惠康基金會(huì)桑格研究所的研究人員，描述了一種基于Cas9D10A的篩查方法，將一種一體化的Cas9D10A切口酶載體與熒光激活的細(xì)胞分選富集相結(jié)合，隨后是高通量的基因型和表型克隆篩選策略，可高效地生成同基因敲除和敲入，同時(shí)具有最低的脫靶效應(yīng)。

CRISPR-Cas系統(tǒng)在細(xì)菌和古細(xì)菌的適應(yīng)性免疫中發(fā)揮作用，以攻擊入侵的外來遺傳因子。最近，釀膿鏈球菌2型CRISPR-Cas9系統(tǒng)，已被用來通過誘導(dǎo)DNA雙鏈斷裂（DSBs）進(jìn)行基因組工程，DSBs可通過非同源末端連接（NHEJ）或同源引導(dǎo)的修復(fù)（HDR）而得以修復(fù)。誘變NHEJ能夠在修復(fù)位點(diǎn)誘導(dǎo)插入或缺失，這可能會(huì)導(dǎo)致開放閱讀框的移碼突變，從而產(chǎn)生截短體蛋白和在mRNA中產(chǎn)生過早成熟的停止密碼子，這是無義介導(dǎo)的mRNA降解的一個(gè)關(guān)鍵誘導(dǎo)物。

另外，HDR允許精確的基因敲入遺傳修飾，如點(diǎn)突變、插入和表位標(biāo)記。CRISPR-Cas9系統(tǒng)可有效地生成基因組修飾，僅僅依靠一個(gè)PAM和一個(gè)與靶基因互補(bǔ)的sgRNA。然而，sgRNA可能經(jīng)常被設(shè)計(jì)為對(duì)靶位點(diǎn)有很高的特異性（在大的基因組，如哺乳動(dòng)物基因組），通常相關(guān)序列包含一個(gè)或多個(gè)與sgRNA不匹配的基因，從而會(huì)產(chǎn)生潛在不良的脫靶效應(yīng)。事實(shí)上，越來越多的證據(jù)表明，這樣的脫靶效應(yīng)可能會(huì)影響最終實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并限制了CRISPR-Cas9的效用，特別是在臨床設(shè)置中。

最近的研究表明，CRISPR-Cas9脫靶效應(yīng)可能由幾種方法誘導(dǎo)，包括利用縮短的sgRNAs、FokI-Cas9融合核酸酶、純化的Cas9核糖核蛋白、修改的sgRNAs或配對(duì)的催化突變Cas9切口酶。雖然這些方法當(dāng)中有幾種方法能達(dá)到較低的脫靶效應(yīng)，但代價(jià)是，會(huì)降低打靶效率。

有很多研究都集中在Cas9切口酶（RuvCD10A或HNHH840A），不同于野生型Cas9——會(huì)產(chǎn)生遲鈍的DSBs，它們只切割DNA的一條鏈，產(chǎn)生可被如實(shí)修復(fù)的單鏈斷裂（SSB），而不會(huì)誘導(dǎo)插入和缺失。為了產(chǎn)生DSBs，最近有研究開發(fā)了一種雙切口策略，包括靶定相鄰區(qū)域的配對(duì)切口酶，從而意味著脫靶DSBs的可能性減至了最小化。然而，多個(gè)質(zhì)粒的共轉(zhuǎn)讓，包括一個(gè)Cas9切口酶、兩個(gè)sgRNA和一個(gè)熒光標(biāo)記，可能會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率和定向誘變，因此，到目前為止，這種方法的廣泛使用受到了限制。

在這項(xiàng)研究中，研究人員描述了一種基于Cas9D10A的篩查方法，將一種一體化的Cas9D10A切口酶載體與熒光激活的細(xì)胞分選富集結(jié)合，隨后是高通量的基因型和表型克隆篩選策略，可高效地生成同基因敲除和敲入，同時(shí)具有最低的脫靶效應(yīng)。研究人員在三種不同的人細(xì)胞系中，通過靶定DNA損傷反應(yīng)（DDR）蛋白MDC1、53BP1、RIF1和P53，以及核架構(gòu)蛋白Lamin A/C的基因，驗(yàn)證了這種方法。

研究人員還利用單鏈寡脫氧核苷酸作為同源模板，有效地獲得了雙等位基因敲入克隆，在RIF1位點(diǎn)插入了一個(gè)EcoRI識(shí)別位點(diǎn)，并在組蛋白H2AFX位點(diǎn)引入一個(gè)點(diǎn)突變，以抑制DDR因子在DNA雙鏈斷裂位點(diǎn)的組裝。這種通用的篩查方法，應(yīng)該有助于旨在確定基因功能、模擬癌癥和其他疾病的研究，并探索新的治療機(jī)會(huì)。