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Nature子刊:液體活檢技術(shù)的新進(jìn)步

日期:2016-03-30 10:22:31

 循環(huán)腫瘤DNActDNA)的高通量測(cè)序有望實(shí)現(xiàn)個(gè)性化的癌癥治療。不過,血液中的游離DNAcfDNA)有限,限制了分析靈敏度。為此,斯坦福大學(xué)的研究人員近日開發(fā)出一種錯(cuò)誤校正方法,能夠檢測(cè)到頻率低至0.004%的突變等位基因。

 

在周一發(fā)表的《Nature Biotechnology》上,研究人員介紹了這種稱為集成數(shù)字錯(cuò)誤抑制(IDES)的方法。它是基于斯坦福團(tuán)隊(duì)之前開發(fā)的一種ctDNA檢測(cè)技術(shù),名為CAPP-seq,目前已被羅氏收購(gòu)。

 

之前,CAPP-seq技術(shù)的檢測(cè)極限是0.02%,不過許多測(cè)序片段都有錯(cuò)誤。為了解決這些錯(cuò)誤,研究團(tuán)隊(duì)首先設(shè)計(jì)了一種分子條形碼策略。許多ctDNA檢測(cè)開發(fā)者也采用這種方案來降低錯(cuò)誤率。單鏈DNA和雙鏈DNA條形碼策略都存在,不過都有缺點(diǎn)。雙鏈DNA條形碼在降低錯(cuò)誤上更佳,但效率不及單鏈DNA條形碼,因此不適合ctDNA量有限的樣本。

 

為此,他們著手設(shè)計(jì)出一種混合策略。首先,他們?cè)O(shè)計(jì)出測(cè)序接頭,可用于單鏈和雙鏈的分子條形碼。雙鏈分子的每條鏈上首先標(biāo)記一個(gè)四堿基條形碼,稱為索引條形碼。接著,他們?cè)趦蓷l鏈的每個(gè)接頭上添加兩個(gè)二堿基條形碼,稱為插入條形碼。在測(cè)序之后,互補(bǔ)的插入條形碼可匹配,重新構(gòu)建出原始的雙鏈DNA分子。

 

第二步,斯坦福的團(tuán)隊(duì)設(shè)計(jì)了一種計(jì)算工具,可以校正測(cè)序或PCR的系統(tǒng)錯(cuò)誤。為了實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn),他們首先對(duì)12名健康成人的樣本開展CAPP-seq檢測(cè)。研究人員報(bào)告稱,盡管所有種類的SNV都有背景錯(cuò)誤,但最常見的是GT的顛換,而CTGA的錯(cuò)誤也有。

 

他們發(fā)現(xiàn),GT錯(cuò)誤的出現(xiàn)是因?yàn)殡s交捕獲過程中的氧化損傷。他們利用一種計(jì)算方法來抑制這些錯(cuò)誤。這兩種策略的結(jié)合,使得錯(cuò)誤率下降了15倍,這是通過30個(gè)健康對(duì)照樣本和142個(gè)非小細(xì)胞肺癌樣本證實(shí)的。

 

研究人員也在NSCLS樣本上驗(yàn)證了此檢測(cè)。首先,他們檢測(cè)了41名晚期NSCLS患者的EGFR熱點(diǎn)突變。他們?cè)?span lang="EN-US">88個(gè)血漿樣本中檢測(cè)到412個(gè)EGFR變異,所有變異都已經(jīng)通過腫瘤活檢樣本確認(rèn)。此外,這項(xiàng)檢測(cè)未檢出任何假陽性。

 

接著,他們?cè)趨⒖技?xì)胞系上評(píng)估了檢測(cè)的技術(shù)限制。他們創(chuàng)建了參考細(xì)胞系混合物,其中變異的等位基因的頻率在0.05-1.6%。他們發(fā)現(xiàn),條形碼策略和計(jì)算校正方法是互補(bǔ)的,結(jié)合使用效果更佳。這種方法的理論檢測(cè)極限是0.00025%

 

最后,他們利用這種方法來監(jiān)控30NSCLC患者中的突變,這些患者的腫瘤已經(jīng)過基因分型。研究人員發(fā)現(xiàn),他們能夠檢測(cè)到頻率低至0.004%的突變。“據(jù)我們所知,這是到目前為止深度測(cè)序檢測(cè)到的最少量ctDNA,”作者寫道。

 


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