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Cell發(fā)布CRISPR/Cas9重要研究成果

日期:2016-03-01 09:02:18

 來自東京大學、麻省理工學院與哈佛大學Broad研究所的研究人員,在新研究中揭示出了新兇手弗朗西絲菌Cas9(FnCas9)的結構,并利用這一結構信息對FnCas9進行改造構建出了一個變異體。研究成果發(fā)布在225日的《細胞》(Cell)雜志上。

 

京東大學醫(yī)學科學研究所基礎醫(yī)學系Osamu Nureki教授,及Nureki實驗室生物物理學和生物化學助理教授Hiroshi Nishimasu是這篇論文的共同通訊作者。Broad研究所核心成員張鋒(Feng Zhang)博士是這篇論文的合著作者。20142月,張鋒曾與Nureki教授聯(lián)手合作生成了CRISPR/Cas系統(tǒng)關鍵組成部分——Cas9復合體的第一張高分辨率圖像。這一重要的研究成果發(fā)布在Cell雜志上。

 

來自CRISPR- Cas系統(tǒng)的RNA引導DNA核酸內切酶Cas9,可以結合雙RNA導向序列crRNA CRISPR RNA)和tracrRNAtrans-activating RNA),或合成的單導向RNA(sgRNA),切割與導向RNA互補的雙鏈靶DNA。當前有幾種Cas9直系同源物,例如化膿性鏈球菌Cas9 (SpCas9)和金黃色葡萄球菌Cas9 (SaCas9)已被利用于真核生物細胞中實現(xiàn)基因組編輯。科學家們還在致力不斷地改進這些技術。

 

在發(fā)表于201511Nature Biotechnology雜志上的一篇研究論文中,研究小組報告稱演化出了SaCas9的一種變體,它能夠識別更廣泛的核苷酸序列,靶向以往CRISPR-Cas9技術無法觸及的基因組位點。

 

201512月,張鋒領導麻省理工學院-哈佛醫(yī)學院Broad研究所和麻省理工學院McGovern腦研究所的研究人員,設計改造了革命性的CRISPR-Cas9基因編輯系統(tǒng),大大減少了“脫靶”編輯錯誤。這一完善的技術解決了使用基因組編輯時面對的一個主要技術問題。研究論文發(fā)表在Science雜志上。

 

除了要求RNA-DNA互補配對,Cas9識別和切割DNA還需要在靶DNA序列的鄰近下游存在“PAM”( protospacer adjacent motif)的短DNA序列,由此限制了Cas9介導基因組編輯可靶向序列的范圍。來自不同微生物的Cas9直系同源物識別不同的PAM序列,SpCas9SaCas9分別識別5-NGG-3′和5-NNGRRT-3 PAMs

 

Cas9直系同源物的長度和序列具有高度的差異,氨基酸殘基的數(shù)量在大約900-1600之間,FnCas9是最大的成員之一。FnCas9包含1,629個氨基酸,相比于其他的Cas9直系同源物如SpCas9 (1,368個氨基酸)SaCas9 (1,053個氨基酸)要大得多。值得注意地是,以往的一項研究報道FnCas9不僅可以介導crRNA:tracrRNA依賴性DNA切割,還可介導scaRNA(小CRISPR/Cas相關RNA:tracrRNA依賴的基因表達調控。但目前對于FnCas9執(zhí)行其雙重功能的機制仍不清楚。此外,也尚未探索FnCas9在基因組編輯應用中的潛力。

 

在這篇Cell新文章中研究人員報告稱,獲得了FnCas9sgRNA–靶DNA復合物的晶體結構,分辨率達到1.7 埃(Å)。通過比較FnCas9和其他Cas9直系同源物SpCas9 SaCas9,揭示出了親緣關系遙遠的CRISPR-Cas9系統(tǒng)之間的保守特征及驚人的結構差異。他們發(fā)現(xiàn)FnCas9識別的是5-NGG-3 PAM,并利用這一結構信息構建出了一個識別5-YG-3 PAMCas9異構體。此外,研究人員證實可以將預組裝的FnCas9sgRNA核糖核蛋白(RNP)復合物通過顯微注射到小鼠受精卵中編輯具有5-YG-3 PAM的內源性位點,由此擴大了CRISPR-Cas9工具箱的靶向空間。

 


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