目前為止，科學(xué)家一直未能制備出可產(chǎn)生種系嵌合體的豬多能干細(xì)胞?；?/span>Oct4啟動(dòng)子的熒光報(bào)告系統(tǒng)，可被用于監(jiān)控多能性，是制備真正的豬多能干細(xì)胞的重要工具。1月12日，來(lái)自中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院、吉林大學(xué)和云南農(nóng)業(yè)大學(xué)的研究人員，在國(guó)際著名的綜合性學(xué)術(shù)刊物《PLOS ONE》發(fā)表題為“Generation of Knock-In Pigs Carrying Oct4-tdTomato Reporter through CRISPR/Cas9-Mediated Genome Engineering”的學(xué)術(shù)成果。在這項(xiàng)研究中，研究人員通過(guò)CRISPR/Cas9介導(dǎo)的基因組編輯，制備了攜帶Oct4-tdTomato報(bào)告基因的基因敲入豬。

轉(zhuǎn)基因豬在農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)藥方面都有著廣泛的應(yīng)用。然而，生殖系有活性的豬多能干細(xì)胞（PSCs）目前尚未制備出來(lái)，這阻礙了豬模型的遺傳修飾。為了解決這個(gè)問題，一種可能的解決辦法是，為豬PSCs生成一種熒光報(bào)告系統(tǒng)。

轉(zhuǎn)錄因子Oct4，又名POU5F1，可維持細(xì)胞的多能性，因此，它的表達(dá)反映了干細(xì)胞多能性。豬的Oct4報(bào)告系統(tǒng)之前已有過(guò)報(bào)道。然而，關(guān)于“豬Oct4啟動(dòng)子的基因組結(jié)構(gòu)”的知識(shí)還是有限的；因此，小鼠Oct4啟動(dòng)子被用來(lái)控制EGFP的表達(dá)，豬Oct4基因起始密碼子上游（4000 bp）也被用來(lái)作為Oct4啟動(dòng)子。

小鼠Oct4啟動(dòng)子與豬轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子不能很好地相互作用，4000 bp組成型啟動(dòng)子可能并不包含所有的調(diào)控元件。在豬當(dāng)中，我們可通過(guò)隨機(jī)地將外源報(bào)告載體整合到豬基因組中，構(gòu)建基于小鼠或豬Oct4啟動(dòng)子的熒光報(bào)告系統(tǒng)。組成型表達(dá)載體中Oct4啟動(dòng)子不完全的監(jiān)控區(qū)域，以及這些載體的不確定的整合位點(diǎn)，可能會(huì)影響其調(diào)節(jié)功能的準(zhǔn)確性。此外，拷貝數(shù)變化和內(nèi)源性基因破壞的風(fēng)險(xiǎn)，可能會(huì)進(jìn)一步影響報(bào)告基因的表達(dá)。將一個(gè)報(bào)告基因精確插入內(nèi)源Oct4的框架，可允許內(nèi)源性啟動(dòng)子誘導(dǎo)的報(bào)告基因表達(dá)，而不改變內(nèi)源性Oct4的表達(dá)，從而可提高豬Oct4表達(dá)模擬的精度。

將外源基因敲入豬體細(xì)胞的基因組中，一直都是極為困難的，因?yàn)閭鹘y(tǒng)的同源重組（HR）效率極低。最近發(fā)展起來(lái)的CRISPR/Cas9系統(tǒng)，可在合成的單導(dǎo)向RNA（sgRNA）的輔助下，用簡(jiǎn)單的堿基互補(bǔ)，靶定和編輯特定的基因組位點(diǎn)。該CRISPR/Cas9系統(tǒng)已用于編輯各種生物的基因組，包括原核生物和真核生物。序列特異性核酸酶能有效地在DNA中產(chǎn)生雙鏈斷裂，并通過(guò)同源指導(dǎo)修復(fù)顯著增加HR的效率。

在這項(xiàng)研究中，研究人員構(gòu)建了一個(gè)豬Oct4的報(bào)告系統(tǒng)，其中內(nèi)源性Oct4啟動(dòng)子可直接控制紅色熒光蛋白（RFP）。通過(guò)同源重組（HR），研究人員將2A-tdTomato序列插入并替換豬Oct4基因的終止密碼子。因此，熒光能準(zhǔn)確地顯示內(nèi)源性Oct4的激活。利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)，研究人員獲得了在內(nèi)源性Oct4基因啟動(dòng)子下游具有tdTomato基因敲入的豬胎兒成纖維細(xì)胞（PFF）系。轉(zhuǎn)基因的PFFs可被用作體細(xì)胞核移植（SCNT）的供體細(xì)胞。

研究人員在SCNT胎兒的囊胚和生殖嵴中，檢測(cè)到了強(qiáng)大的RFP表達(dá)。通過(guò)SCNT，研究人員也制備了兩只有生活力的轉(zhuǎn)基因豬。通過(guò)另一輪SCNT對(duì)來(lái)自胎兒和仔豬的成纖維細(xì)胞進(jìn)行重編程，可導(dǎo)致重構(gòu)囊胚中的tdTomato再激活。結(jié)果表明，監(jiān)測(cè)細(xì)胞多能性狀態(tài)的一個(gè)KI豬報(bào)告系統(tǒng)，已被成功構(gòu)建。