Nature子刊發表CRISPR新成果:一步法制備新型gRNA文庫
日期:2015-08-19 10:56:25
CRISPR-Cas9系統是一種強大的基因組編輯工具,如風暴一般席卷了整個基因組工程領域。最近人們開始探索這一系統在其他方面的應用,而這樣的應用往往需要同時表達一對gRNA,比如用Cas9切口酶進行大片段刪除。
紀念斯隆-凱特琳癌癥中心的研究團隊開發了一種簡單又便宜的文庫制備方法,可以快速有效的將配對gRNA克隆到表達載體上,用于體內和體外的功能篩選。這一成果發表在八月十七日的Nature Communications雜志上,文章的通訊作者是紀念斯隆-凱特琳癌癥中心的Andrea Ventura。
CRISPR-Cas9是細菌在漫長的進化過程中演化出的重要防御機制。這個監控體系能夠根據引導RNA(gRNA)的指示,靶標并降解入侵者的遺傳物質。現在,CRISPR-Cas9已經成為了炙手可熱的基因組編輯工具,幫助世界各地的研究者們解決實際問題。近年來,這一技術在多個領域中展現了自己強大的實力,催生了大量的重要成果。
人們發現,同時表達內切酶Cas9與gRNA,可以誘導真核細胞發生雙鏈DNA斷裂。在真核生物中,雙鏈DNA斷裂主要通過容易出錯的非同源末端連接進行修復,會在目標位點形成小indel(插入缺失)。因此,CRISPR-Cas9系統是破壞基因編碼框的一種簡單途徑。研究表明,CRIPSR-Cas9可以高效靶標多個基因,實現大規模的功能缺失篩選。
研究人員開發了一個快速制備配對gRNA文庫的有效方法,大大拓展了CRIPSR在功能篩選方面的應用。該方法可以將寡核苷酸池中的一對gRNA克隆到任意CRISPR 表達載體上,還可以確保兩個gRNA使用獨立的啟動子。
研究顯示,一個慢病毒載體上的兩個gRNA不適合使用相同的啟動子。研究人員為此構建了新型慢病毒載體,搭載一個人類U6啟動子和一個經過改良的鼠類U6啟動子。
這項研究為人們提供了一個簡單、快速又便宜的配對gRNA文庫制備法,大大拓展了CRISPR技術在功能基因組學研究中的應用前景。