能夠將缺陷基因的功能性拷貝插入到患者的基因組中，對于許多從事遺傳疾病治療的臨床醫生來說是一個誘人的目標。現在，斯坦福大學醫學院的研究人員設計出了一種新方法來實現這種遺傳技能。他們的研究論文“Promoterless gene targeting without nucleases ameliorates haemophilia B in mice”發布在10月29日的《自然》（Nature）雜志上。

這種方法不同于其他一些廣受歡迎的技術，它不需要共傳遞內切核酸酶在特異位置剪切受體的DNA。它也不依賴于共同插入稱作為啟動子的遺傳“on”開關來激活新基因表達。

這些差異有可能使得這一新技術更為安全及持久。利用這一技術，斯坦福大學的研究人員通過插入血友病小鼠缺失的一個凝血因子的編碼基因治愈了這些動物。

論文的資深作者、兒科學和遺傳學教授Mark Kay博士說：“看起來我們能夠實現插入基因的終身表達，這在治療諸如血友病和重癥聯合免疫缺陷等遺傳病時尤為重要。不需使用啟動子或核酸酶我們就能夠做到這一點，由此大大降低了新基因自身插入到基因組中隨機位置而引起癌癥的機會。”論文的主要作者是博士后學者Adi Barzel。

利用這一技術，Kay和同事們將缺失的一個凝血因子的功能性基因拷貝插入到了血友病小鼠的DNA中。盡管只在1%的肝細胞中實現了基因插入，這些細胞生成了足夠的缺失凝血因子來改善這一疾病。

有可能替代CRISPR

斯坦福大學的這一研究發現有可能給稱作為CRISPR/Cas9的基因組技術提供了一種替代選擇。CRISPR/Cas9技術依賴于細菌為抵抗病毒攻擊所形成的一種古老的保護性反應。就像美洲印第安人在戰斗中每殺死一個敵人，便在自己帽子上插一支羽毛作為一種榮譽標志一樣，每一次細菌戰勝病毒，它都會將入侵物的小部分DNA保留于自身的基因組中。累積的這些病毒區域就叫做成簇的規律間隔的短回文重復序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR)區域。當病毒再來之時，細胞便利用保留的遺傳物質片段來鑒別并結合到病毒基因組的匹配區域上。一旦附著，它便會利用Cas9蛋白在精確的位點切割病毒基因。

世界各地的研究人員不僅開始使用這種CRISPR/Cas9技術在實驗動物中永久地讓研究基因喪失功能，還插入了一些新的修飾基因到動物的基因組中。這使得他們能夠快速地構建出遺傳改造試驗動物；這項在過去要花費數月或數年的工作現在只需數天或數周。

然而，CRISPR/Cas9技術不僅需要編碼Cas9核酸酶的基因（其自身就可以整合到受體的基因組中），還需要啟動子來驅動基因表達。研究人員擔心如果用于人類，Cas9有可能會在意外的位點切割DNA，這會破壞或是殺死細胞。另外，新基因的啟動子有可能會對鄰近基因的表達造成不利的影響，引起癌癥或其他的疾病。外源的細菌蛋白還可引起患者的免疫反應。

Barzel說：“位點特異性的基因打靶是基因治療和基因組工程中最快速發展的領域之一。但使用核酸酶和啟動子有可能產生顯著不利的影響。我想找到一種新的基因打靶方案，其不涉及載體傳送啟動子，也不需要使用內切核酸酶。”

研究人員設計的這一新技術沒有使用核酸酶來切割DNA，也不需要啟動子來驅動凝血因子基因表達。相反，研究人員將新基因的表達與肝臟中高水平表達的albumin基因聯系在了一起。Albumin基因可編碼生成血液中最豐富的一種蛋白：白蛋白。它幫助調控了血容量，使得一些不易溶于水的分子能夠在血液中傳輸。

研究人員利用了基因治療中常用的一種病毒——腺相關病毒（AAV）的改良版本。在這一改良的病毒載體中，所有的病毒基因被刪除，只保留了治療基因。它們依賴于一種稱作為同源重組的生物學現象來將凝血因子基因插入到albumin基因附近。通過在兩基因間使用一種特殊的DNA接頭（linker），研究人員能夠確保凝血因子蛋白的生成與高表達的白蛋白密切關聯。

在同源重組過程中，細胞利用了自身每條染色體具有兩個拷貝這一事實。通過將受損和未受損的染色體排列在一起，細胞可以借鑒完整的拷貝來修復受損染色體，因此不會丟失至關重要的遺傳信息。Kay和Barzel利用同源重組這一自然過程，將來自病毒載體的序列拷貝到了基因組中研究人員指定的位置——在本例中，是在albumin基因的后面。

在新生和成體小鼠中都有效

當他們在新生實驗室血友病小鼠中測試他們的方法時發現動物開始表達凝血因子，且表達水平達到了正常水平的7-20%。以往的研究證實這樣的凝血因子量在小鼠中具有治療效應。他們進一步證實，這一技術令人驚奇地也可成體動物中起作用，盡管基因只成功地插入到了不到1%的肝細胞中。

Kay說：“我們預期這種方法能夠在新生動物中起作用，因為它們的肝臟仍然在生長。由于一直以來人們認為同源重組大多發生在增殖細胞中，我們沒有料到它也能夠在成體動物中起作用。”

多年來Kay一直致力于血友病的基因治療。在2006年，他作為一個研究小組的領導者，利用AAV向罹患B型血友病的患者提供了一種凝血因子基因。B型血友病沒有A型血友病那樣常見，每2.5萬名男孩中有一人受累于這一疾病（由于這一疾病是由X染色體上的一個缺陷基因所引起，它很少影響女孩）。然而，由于這一缺失凝血因子的基因較小，更易于基因治療操作，因此B型血友病更容易靶向治療。

正如許多的病毒一樣，AAV也具有不同的病毒株。不幸的是，在2006年的研究中采用的這種AAV病毒株在人體表達凝血因子只維持了數月，不同于在動物體內長期的表達。近期，英國啟動了另一項相似的臨床試驗，利用了一種不同的AAV病毒株，研究人員在患者接受改良病毒后的兩年多時間觀察到了6名患者體內的凝血因子表達。

Kay 說：“AAV的真正問題在于，當基因不整合到基因組中去時不清楚其表達將能夠維持多久。能夠從治療中最大受益的嬰兒和兒童仍然在生長，由于不能在細胞之間拷貝，非整合的基因會失去它的效力。此外，由于患者會對AAV產生免疫反應不太可能再給予這種治療。而獲得整合，我們就可以實現終身表達，且不必擔心癌癥或其他的DNA損傷。”

研究人員現正計劃在肝臟包含有人類和小鼠細胞的小鼠中測試這一技術，他們近期證實了這種模型可以是進一步預測人體中所發生事件的一個好的替代物。